钙和维生素D膳食补充对大鼠踝关节骨折创伤模型破骨细胞活性和骨量的影响分析

彭亮杨鹏刘冲杨金丰马三辉

(定州市人民医院骨科，河北定州 073000)

踝关节骨折是临床上常见的手足创伤疾病，钙和维生素(Ca/VitD)缺乏可能是影响创伤后骨折愈合的重要因素[1]。VitD通过影响肠钙吸收、肾钙再吸收和破骨细胞骨吸收来调节钙稳态[2]。VitD缺乏和低钙供应都会通过骨吸收增加而维持血液中的钙，从而降低骨量和质量[3]。此外，Ca/VitD缺乏症也可能导致踝关节骨折患者中常见的骨折愈合并发症[4]，因为钙对骨折-愈伤组织矿化是必不可少的。但是目前Ca/VitD在手足创伤踝关节骨折愈合中的作用仍未得到很好的研究，补充Ca/VitD是否有助于手足创伤骨折愈合也存在争议[5]。最近，有团队研究了由次氯酸钠引起的钙吸收不良的大鼠骨折愈合，发现骨折后骨愈合不受影响，而骨骼破骨细胞活性显著增加[6]。这些结果表明，当骨吸收不符合愈伤组织矿化的要求时，创伤后骨吸收增强。与此结果一致，临床研究中观察到骨折后全身骨丢失，其表现为骨密度(BMD)降低高达15%[7]。创伤后骨丢失可显著增加继发性骨折的风险[8]。因此得出假设，创伤后骨丢失可能在Ca/VitD缺乏的情况下发生，然而目前缺乏相关研究。

因此，本研究采用手足创伤踝关节骨折大鼠模型，研究饮食中Ca/VitD缺乏是否会损害骨修复。此外还探讨了从踝关节创伤的时间点开始在饮食中补充Ca/VitD对Ca/VitD缺乏饮食者破骨细胞活性和骨量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24只清洁级雄性SD大鼠，8周龄，体重约为220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2015-0004】。饲养于定州市人民医院动物实验室【SYXK(冀)2015-0018】。饲养期间各组大鼠自由饮水，提供足够饲料。饲养环境：湿度恒定，温度控制在22～25℃。所有操作均符合定州市人民医院实验动物管理和使用委员会要求(审批号：DZPH-DW2018003)。

1.1.2 主要试剂与仪器

RNAlaterTM(Sigma-Aldrich)，大鼠抗小鼠FGF23(MAB26291，R＆D Systems Inc，美国)，兔抗小鼠FGFR1/CD331(PA5-25979， Invitrogen， Thermo Fisher Scientific，美国)，生物素偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(B2770，Invitrogen，美国)和生物素偶联的山羊抗大鼠IgG(A10517，Invitrogen，美国)。

高分辨率台式CT(Skyscan 1172，比利时)，倒置荧光显微镜(奥林巴斯，IX73，日本)，低温高速离心机(Eppendorf，德国)，TP600 型 PCR 仪(TaKaRa，日本)。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

将大鼠随机分为三组。对照组C组标准喂食(Ca 0.5%，VitD 2000 IU/kg)，而D组和S组则接受Ca/VitD缺乏饮食(Ca 0.25%，VitD 0 IU/kg)。8周后，所有大鼠均接受手术构建大鼠手足创伤踝关节骨折模型。手术后立即将S组转入补充Ca/VitD的饮食(Ca 2.0%，VitD 2000 IU/kg)。第10天和第23天处死大鼠(n＝8)，并评估手足创伤术后踝关节骨折愈合情况。本研究动物实验经伦理委员会的审核批准。

1.2.2 手术

踝关节骨折手术采用2%异氟烷全麻下进行。为了镇痛，大鼠在手术前1 d至术后3 d饮用水中加入25 mg/mL盐酸曲马多。手术前，所有大鼠均皮下注射抗生素克林霉素-2-二氢磷酸酯(45 mg/kg)。对踝关节进行无菌处理后，将大鼠仰卧卧位，右侧髋关节外展90°。右膝关节弯曲90°。然后在内踝处做1 cm纵行切口，钝性分离皮下筋膜及肌腱，暴露内踝。小骨凿与角度固定器(37°)组合后置于胫骨远端，中等力度将骨凿敲入内踝，然后采用缝线缝合，术后允许其自由活动。

1.2.3 血清分析

在给予手术创伤时(眼眶取血)和实施安乐死当天(心脏穿刺)获得大鼠血液样本。I型胶原C端端肽(CTX)、I型前胶原N端肽(PINP)、甲状旁腺激素(PTH)和成纤维细胞生长因子23(iFGF23，完整和C末端)血清水平采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定。

1.2.4 微型计算机断层扫描(μCT)分析

在第23天，采用μCT扫描设备以8 μm的分辨率，50 kV的电压和200 μA的电压对踝关节进行成像。使用μCT图像在两个垂直平面上评估了每个愈伤组织桥接皮质的数量。当观察到每个愈伤组织≥3个桥接皮质时，该骨折被认为“已成功治愈”。

1.2.5 组织形态计量学和免疫组化

将第10、23天的踝关节植入甲基丙烯酸甲酯或石蜡中。采用番红O染色法进行组织形态学分析，用图像分析软件测定整个愈伤组织中骨、软骨和纤维组织的相对数量。第23天采用抗酒石酸磷酸酶染色后，根据ASBMR指南评估骨细胞参数[9]。利用图像分析软件，在踝关节骨折愈伤组织中间1.8 mm×0.9 mm区域进行成骨细胞和破骨细胞计数。采用抗体和稀释液对踝关节(D23)的石蜡包埋切片进行FGF23和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)进行免疫组织化学染色。

1.2.6 骨折愈伤组织的基因表达分析

在第23天，收集踝关节愈伤组织并在4℃下储存在RNAlater中。去除RNAlater后，将断裂愈伤组织在液氮中快速冷冻，并在振动磨中以30 Hz的频率粉碎1.5 min。采用试剂盒分离总RNA，将1 μg分离的RNA转录为cDNA，然后进行定量聚合酶链反应(qPCR)。引物序列如下：碱性磷酸酶(ALP，F： 5′-GCTGATCATTCCCACACTTTT-3′和 R： 5′-GAGCCAGACCAAAGATGGAG-3′)，维生素 D 受体(VDR，F：5′-GGGCTTCCACTTCAACGCTA-3′和 R：5′-CATGCTCCGCCTGAAGAAAC-3′)，X 连锁磷酸盐调 节 基 因 (Phex， F： 5′-TTCCCCAGAGTTTGAC TGGCTG-3′和 R： 5′-TCTCCGAGGGACCAATGTCT-3′)， FGF23(F： 5′-ACAGGAGCCATGACTCGAAG-3′和 R：5′- 将 GCAATTCTCTGGGCTGAAGT-3′) 和FGFR1(F：5′-TGACGACGACGATGACTCCT-3′和 R：5′-AGCTACAGGCCTACGGTTTG-3′)，管家基因 β-2-微球蛋白(F：5′-ATACGCCTGCAGAGTTAAGCA-3′和R：5′-TCACATGTCTCGATCCCAGT-3′)。

1.3 统计学分析

本研究采用GraphPad Prism 6软件对数据进行整理及分析。数据结果表示为平均值±标准差()。当三组相互比较时，通过单因素方差分析(ANOVA)和事后Fishers LSD分析数据的显著性，采用t检验比较两组样本的显著性。通过卡方检验分析骨折愈合数据。P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 手足创伤前大鼠血清及μCT分析结果

手足创伤前在未骨折(D组和S组)大鼠和对照组(C组)大鼠之间，血清、μCT和组织形态学参数差异无显著性(P＞0.05)(表1)。

2.2 饮食中Ca/VitD缺乏对骨折愈合的影响

为评估Ca/VitD缺乏饮食对大鼠手足创伤术后骨折愈合的影响。创伤后第10天，未观察到Ca/VitD缺乏对愈伤组织的显著影响。到第23天，与C组大鼠相比，D组大鼠的骨折愈伤组织中的BMD显著降低(P＜0.05)，BV/TV没有显著性差异(P＞0.05)，而在组织形态计量学中，D组大鼠在新形成的愈伤组织中骨量显著减少(P＜0.001)，纤维组织量显著增加(P＜0.05)(见表2，图1A，1B)，而在骨折的愈伤组织中，D组大鼠破骨细胞的数量和表面显著增加(P＜0.01)，D组的成骨细胞活性没有显著性差异(图1C)。这些结果表明在D组大鼠中骨含量略有减少，说明在Ca/VitD缺乏饮食组中手足创伤术后骨愈合受到了中度干扰。

2.3 饮食中Ca/VitD补充对骨折愈合的影响

Ca/VitD补充剂S组在骨折后10 d无明显影响。到第23天，S组在踝关节愈伤组织中的BMD略有增加，但没有显著增加。与D组相比，S组大鼠的愈伤组织中的骨量显著增加(P＜0.01)，而纤维组织部分显著减少(P＜0.05)。此外，S组表现出较高的骨折愈合率(P＜0.05)(表3)。

与D组相比，手足创伤术后23 d，S组大鼠的骨痂成骨细胞标志物ALP mRNA表达显著增加(P＜0.05)，血清PTH水平显著降低(P＜0.001)，和C组相比骨吸收标记物CTX的血清水平降低，但骨形成标记PINP的血清水平差异无显著性(P＞0.05)。这些结果表明，在手足创伤术后开始的Ca/VitD补充减少甚至补偿了慢性Ca/VitD缺乏的负面影响(表3)。

与此同时，S组iFGF23及cFGF23的血清水平均显著升高，与D组，C组相比较具有显著性差异(P＜0.05)。但iFGF23：cFGF23三组无显著性差异(P＞0.05)说明饮食中补充Ca/VitD对骨折愈伤组织中的iFGF23，cFGF23表达水平具有关联性。与D组的相比，S组中 Phex mRNA表达显著增加(P＜0.05)，证实了FGF23运转率提高，见表3。

表1 手足创伤前大鼠μCT及血清分析结果(n＝8)Table 1 CT and serum analysis results of rats before hand and foot trauma(n＝8)

表2 创伤后第23天大鼠骨折愈伤组织μCT分析结果(n＝8)Table 2 CT analysis of callus of rat fracture on day 23 after trauma(n＝8)

表3 骨折后第23天大鼠骨折愈合参数及血清分析结果(n＝8)Table 3 Fracture healing parameters and serum analysis results of rats on 23 d after fracture(n＝8)

图1 大鼠踝关节的组织形态学分析结果Note.A.Percentage of bone， cartilage and fibrous tissue in the fracture callus at 10 d.B.Percentage of bone， cartilage and fibrous tissue in fracture callus at 23 d.C.Ankle callus stained with safflower O and tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP).Figure 1 Histomorphological analysis results of rat ankle joint

3 讨论

本研究研究了Ca/VitD在手足创伤术后骨折愈合中的作用。慢性膳食Ca/VitD缺乏大鼠踝关节骨折后血清PTH水平明显升高，破骨细胞活性增加。踝关节骨折创伤术后补充Ca/VitD可促进愈合。因此，本研究证明了在手足创伤术后骨折愈合过程中充足的Ca/VitD的供应可减少Ca/VitD缺乏饮食者破骨细胞活性和增加骨量，改善骨修复，在临床上具有高度的相关性。

由于钙在骨再生过程中对愈伤组织矿化至关重要，因此，本研究研究了Ca/VitD缺乏是否影响骨修复。D组表现出中等程度的骨折愈合，骨折愈伤组织中骨含量减少及破骨细胞数量增加。D组的PTH水平高可能是愈伤组织中破骨细胞活性显著增加的原因。关于Ca/VitD缺乏对骨愈合的影响，目前对大鼠的研究数量有限，已有少量研究报道了对愈伤组织矿化和生物力学骨特性的相互矛盾的影响[10-11]。与本研究结果一致，愈合受损和不愈合的患者与正常愈合的患者相比，血清维生素D水平较低[12]。此外，本研究证明了补充Ca/VitD可以消除先前缺乏饮食的负面影响，这一点可以通过骨折愈伤组织中骨量增加得到证明。

VitD对骨再生的积极作用主要是通过其对钙稳态的内分泌作用间接发挥作用，从而增加骨折愈伤组织矿化的钙供应。然而，维生素D对骨骼的直接影响也被广泛讨论，因为成骨细胞表达VDR，其在这些细胞上的表达直接受生物活性1，25(OH)2D3调控[13]。体外研究表明1，25(OH)2D3和VDR可增强成骨细胞分化和矿化，表现为成骨细胞分化标志物ALP活性增加[14]。本研究证明了补充Ca/VitD大鼠手足创伤术后骨折愈伤组织中VDR和ALP的表达增加。基于这些结果，可以说明增强的1，25(OH)2D3/VDR信号在骨折愈伤组织中的局部作用可能也有助于Ca/VitD治疗诱导的骨折愈合改善。然而，需要进一步的研究探讨其确切机制。

此外，本研究还研究了FGF23，是矿物质和VitD代谢的调节剂，对有效的骨愈合非常重要。在S组大鼠中，iFGF23和cFGF23血清水平均显著增加，表明FGF23周转率提高。但是，iFGF23：cFGF23的比例未改变，可能表明其生物活性FGF23不变。与此一致，骨折愈伤组织中的FGF23和FGFR1表达不受Ca/VitD补充的影响，表明局部FGF23信号不受影响。骨折愈伤组织中的内肽酶Phex mRNA表达增加，表明FGF23裂解支持大鼠中FGF23更新。但是，需要进一步的研究来证实。

总之，本研究表明，Ca/VitD补充剂在踝关节创伤术后可减少Ca/VitD缺乏饮食者破骨细胞活性和增加骨量，改善骨修复，可减少患者发生继发性骨折的风险。