程序性坏死的诱导剂和抑制剂及其在疾病中作用的研究进展

曹力元，牟 为

上海交通大学公共卫生学院，上海 200025

程序性坏死（necroptosis）是近年来新发现的一种细胞死亡方式。传统理论认为，细胞死亡分为凋亡和坏死。其中细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞在一定条件下通过启动自身内部信号通路，主要通过内源性DNA 内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程，是一种主动有序的细胞死亡方式。而坏死（necrosis）是细胞受到强烈理化或生物因素的作用而产生的一种无序死亡过程，其发生是不可控的，且往往具有不可逆性。随着相关研究的逐渐深入，研究人员发现了另外一种细胞死亡方式，具有与坏死类似的形态学特征，但却受细胞内特定的信号通路调控，并且在凋亡被抑制的条件下，作为一种替代方式来介导细胞死亡。2005 年，Degterev 等[1]首次提出了程序性坏死的概念，即指细胞的一种程序性死亡（programmed cell death）方式（程序性死亡还包括凋亡和焦亡）。他们发现，一种小分子化合物necrostatin-1（Nec-1）可以抑制程序性坏死的发生，进一步证明了程序性坏死的可调控性。在程序性坏死的信号通路中，最核心、最经典的通路由3 个重要部分组成：受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）和混交激酶域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）。由此得出一个与传统理论不同的观点，即坏死也可以是细胞的一种程序性死亡方式，其发生和发展是可调控的。本文重点讨论程序性坏死在疾病中的作用，包括在肿瘤和炎症性疾病中的双重作用，并探讨程序性坏死的诱导剂和抑制剂，以及诱导或抑制程序性坏死所具有的科研和临床意义。

1 程序性坏死在疾病中的影响及调控

程序性坏死与多种疾病相关。以往的研究认为，程序性坏死参与了炎症性疾病和缺血再灌注等疾病的发展过程；近年来的研究[2-3]表明，程序性坏死与恶性肿瘤也密切相关，其有望成为抗癌治疗的一个新靶点。

1.1 肿瘤

以往很多程序性坏死相关疾病的研究是聚焦于炎症性疾病，然而近年来，越来越多的研究开始关注程序性坏死在肿瘤中的作用。研究[2]表明，程序性坏死相关分子RIPK1、RIPK3 和MLKL 与放射治疗（放疗）后的肿瘤再增殖密切相关。此外，乳腺癌和肺癌等肿瘤细胞能够诱导内皮细胞发生程序性坏死，进而导致肿瘤细胞外渗和转移。使用程序性坏死抑制剂Nec-1 或条件性敲除内皮细胞Ripk3 基因能够减少肿瘤细胞诱导的内皮细胞坏死，抑制肿瘤细胞外渗和转移[4]。虽然内皮细胞程序性坏死可能利于肿瘤转移，但是诱导肿瘤细胞发生程序性坏死却有望成为治疗肿瘤的新策略。许多研究[5-6]表明，程序性坏死通路中的关键蛋白在某些肿瘤中是低表达的，比如RIPK3在原发性结肠癌中低表达[6]。由此可以推断，在某些肿瘤的发生发展过程中程序性坏死被抑制，这有可能是肿瘤细胞恶性增殖的原因之一。目前，抗癌药的机制主要是靶向诱导肿瘤细胞发生凋亡，但存在肿瘤细胞耐药问题。Han等[3]人发现，在耐药肿瘤细胞中可以通过激活程序性坏死通路来介导肿瘤细胞死亡。事实上，程序性坏死被认为是细胞凋亡受到抑制或阻断时发生的一种替代性死亡方式[7]。虽然前面提到程序性坏死会促进肿瘤转移，但也有研究[8-9]发现天然化合物紫草素和酯蟾毒配基能通过激活程序性坏死从而抑制肿瘤转移。因此，程序性坏死有望成为肿瘤治疗的新靶点。

1.2 炎症性疾病

发生了程序性坏死后，细胞破裂，细胞的炎性物质（如炎症因子等）释放进入组织液中，引起炎症反应；同时炎症反应又能引起包括程序性坏死的细胞坏死。与程序性坏死相关的炎症性疾病包括肠炎、肾炎和骨关节炎等。以肠炎[10]为例，建立小肠上皮细胞Fas 相关死亡域蛋白（Fas-associated protein with a novel death domain，FADD）基因敲除的小鼠模型后，小鼠马上发生了小肠炎和大肠炎。然而敲除Ripk3 基因则能阻止肠炎的发生，表明程序性坏死参与了肠炎的发生过程。RIPK1 和RIPK3 能激活炎症信号通路，分泌促炎因子。如RIPK3 能够激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligometric domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小体，引起白细胞介素-1（interleukin 1，IL-1）等细胞因子的释放。进一步研究[11]表明，RIPK3 在Mlkl 敲除的情况下仍能激活NLRP3，表明在细胞死亡前炎症反应就已经发生。事实上，程序性坏死还参与其他疾病，如缺血再灌注损伤、神经退行性疾病等的炎症反应，加重细胞或组织损伤。

综上所述，程序性坏死在疾病中的作用可分为2 个方面：既能促进肿瘤转移、诱导和加重炎症性疾病，是一个危险因素；又能介导肿瘤细胞的死亡，提供了一个潜在的治疗策略。

2 程序性坏死的诱导机制及诱导剂

2.1 诱导机制

程序性坏死可由肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、DNA 损伤、辐射等引起，其中以TNF 诱导发生的程序性坏死最为经典。本文重点讨论TNF-α 诱发程序性坏死的信号通路。TNF-α 为TNF 的一种分型，是重要的促炎细胞因子，参与介导多种炎症反应。TNF-α 激活肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）可引起多种信号通路，包括核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、RIPK1 非依赖性凋亡（RIPK1 independent apoptosis，RIA）、RIPK1 依赖性凋亡（RIPK1 dependent apoptosis，RDA）和程序性坏死。三聚型TNF-α 激活TNFR1，通过结合外侧死亡结构域的方式招募RIPK1 和肿瘤坏死因子受体1 相关死亡域蛋白（TNFR1-associated death domain protein，TRADD）；TRADD 招 募 肿 瘤 坏 死因子受体相关因子2/5（TNF receptor-associated factor 2/5，TRAF2/5）和E3 泛素连接酶cIAP 1/2，形成复合物complex Ⅰ。如果complex Ⅰ中的TRADD 招募FADD 和半胱天冬酶caspase-8，在细胞内形成复合物complex Ⅱ a，则介导RIA。如果RIPK1 形成RIPK1 二聚体，与FADD和caspase-8 形成复合物complex Ⅱ b，则介导RDA。而当caspase-8 活性被抑制时，RIPK1 二聚体与RIPK3 结合形成复合物complex Ⅱ c（即RIPK1-RIPK3 复合物，又称为necrosome），complex Ⅱ c 进一步募集并磷酸化MLKL，MLKL 作为细胞死亡的执行者最终会导致程序性坏死的发生[7]（图1）。

图1 程序性坏死的调控通路及其与不同疾病的关系Fig 1 Signaling pathways of necroptosis and its role in different diseases

虽然TNF 不仅诱导细胞发生凋亡，还启动程序性坏死，具有强大的肿瘤细胞杀伤作用，但当大量的TNF 进入机体循环系统时，会产生类似脓毒血症的症状，甚至引起中毒性休克，最终导致多器官衰竭和死亡。TNF 严重的不良反应使得其在临床上的应用受到了极大的限制，目前仅应用于少数疾病的局部治疗，如TNF 与γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和米尔法兰（melphalan）联合治疗四肢黑色素瘤和软组织肉瘤[12]，采用孤立肢体灌注方法避免TNF 的系统性反应。考虑到TNF 应用的局限性，寻找一些可替代的程序性坏死诱导剂成为了新的研究方向之一。

2.2 诱导剂紫草素

事实上，通过程序性坏死途径来杀死肿瘤细胞的思路已经在一种天然化合物——紫草素（shikonin）的相关研究中得到了证实。紫草素是从天然植物中提取出来的一种萘醌，可以诱导多种肿瘤细胞发生程序性坏死，发挥抗肿瘤的作用，如胶质瘤、鼻咽癌、骨髓瘤和淋巴瘤等。在胶质瘤细胞系中，紫草素能够诱导细胞死亡并引起RIPK1、RIPK3 和MLKL 的表达水平升高，此过程能被Nec-1 抑制而不能被caspase 抑制剂Z-VAD-fmk 抑制，说明紫草素在胶质瘤细胞中是通过程序性坏死通路引起细胞死亡而不是凋亡通路[13]。紫草素引起胶质瘤细胞发生程序性坏死可能与胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量累积有关。程序性坏死的过程往往伴随着ROS 水平升高，ROS 累积能够引起双链DNA 断裂。使用线粒体超氧物清除剂抑制ROS 的生成能阻止紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡，而使用ROS 促进剂能显著提高细胞死亡率[14]。虽然研究[14]表明ROS 位于RIPK1 和RIPK3 的下游通路，但是清除ROS 会抑制RIPK1 和RIPK3 的结合，而增加ROS能够促进两者的结合，说明ROS 的生成反过来又能促进RIPK1-RIPK3 复合物的形成。除了有望应用于胶质瘤和骨髓瘤这样尚无有效治疗方法的疾病，紫草素还可以通过诱导程序性坏死来应对肿瘤耐药问题。Han 等[3]发现，紫草素能在人乳腺癌细胞系MCF-7 中诱导细胞发生程序性坏死，这种非凋亡途径的细胞死亡方式启发研究人员进一步探索紫草素在耐药肿瘤细胞系中的作用。在Han 等[3]的研究中，他们采用过表达P 糖蛋白、Bcl-2 和Bcl-xL 的方式构建了2 种不同机制的耐药细胞系模型。实验证明，紫草素能够诱导过表达P 糖蛋白的耐药细胞发生程序性坏死。虽然与非耐药细胞相比，紫草素在耐药细胞中的杀伤作用需要一定的反应时间，但从最终结局来看，过表达P 糖蛋白不会影响紫草素诱导细胞发生程序性坏死。在过表达Bcl-2 和Bcl-xL 的抗凋亡MCF-7 肿瘤细胞系中，相关实验[3]也证实紫草素可以诱导耐药细胞发生程序性坏死。这些实验证明，通过紫草素诱导细胞发生程序性坏死的研究思路有望进一步应用于肿瘤的耐药研究。

2.3 诱导剂苦参碱及其他化合物

苦参碱（matrine）是从中草药苦参中提取出来的一种生物碱，在许多研究中被证实具有抗癌效果，能抑制肿瘤细胞的增殖，阻止肿瘤细胞的转移。Xu 等[15]发现，苦参碱能够在胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）细胞中诱导程序性坏死，肿瘤细胞具有典型的坏死样特征，并且Nec-1 能够抑制细胞死亡。同时，苦参碱能够引起RIPK3表达水平升高，进而活化其下游的MLKL，促进ROS的生成。因此，在苦参碱诱导的CCA 细胞程序性死亡中，既涉及RIPK1-RIPK3-MLKL 信号通路，又有RIPK3-MLKL-ROS 通路的参与。事实上，苦参碱在很多肿瘤研究中被认为是通过诱导细胞凋亡发挥抗癌作用，但在CCA中却是通过诱导细胞程序性坏死而发挥作用。这表明不同的肿瘤细胞对凋亡和坏死的敏感度不一样，某些肿瘤（如CCA）具有坏死敏感性。因此，在某些坏死通路易激活的肿瘤细胞中，可以通过特异性地诱导程序性坏死来杀死肿瘤细胞，从而在一定程度上解决肿瘤的耐药问题。

此外，还有很多其他化合物也可以激活程序性坏死通路（表1）。

表1 程序性坏死的诱导剂Tab 1 Inducers of necroptosis

3 程序性坏死的抑制剂

3.1 特异性抑制剂Nec-1

针对不同的作用靶点，程序性坏死的抑制剂可分为RIPK1 抑制剂、RIPK3 抑制剂和MLKL 抑制剂（表2）。在程序性坏死的抑制剂中，Necrostatins 家族的相关研究最多，其中以Nec-1 最为典型。Nec-1 是一种小分子生物碱，通过作用于RIPK1 的T 环结构，抑制RIPK1 的活性，从而抑制RIPK1-RIPK3 复合体的形成，阻断下游程序性坏死的发生。在实验中，应用Nec-1 后，通常表现为RIPK1、RIPK3 和MLKL 的mRNA 水平和蛋白表达水平下降，以及细胞死亡率下降。

表2 程序性坏死的抑制剂Tab 2 Inhibitors of necroptosis

由于程序性坏死与凋亡的部分上游通路相同，RIPK1的激活在程序性死亡和RDA 信号通路中至关重要，研究[29]表明Nec-1 不仅能阻止程序性坏死，也能抑制细胞凋亡。然而Jie 等[30]却得出了相反的研究结果：在炎症模型中，Nec-1 可以特异性地诱导中性粒细胞发生凋亡，从而减轻炎症反应，发挥抗炎作用。此外，还有一些学者[31]认为Nec-1 不影响凋亡的发生。如此不同的研究结果提示，程序性坏死与凋亡之间可能通过复杂的信号通路网络连接，因此在不同的疾病和条件下应用Nec-1 会产生不同的效应。在TNF-α 引起的经典信号通路中，凋亡分为2 种：RIA 和RDA。当凋亡以RIA 为主时，由于此时凋亡的发生不依赖RIPK1，故Nec-1 不影响凋亡的发生；而当凋亡的方式是RDA 时，Nec-1 抑制RIPK1 的活性，导致complex Ⅱ a 无法形成，故凋亡通路受阻。而导致Jie 等[30]的研究结果的原因可能是凋亡与程序性坏死在一定条件下可以互相转换，当凋亡被抑制时，细胞通过程序性坏死途径死亡，而当程序性坏死被Nec-1 抑制时，细胞转而通过凋亡途径死亡[16]。由此可以看出，Nec-1 在不同条件下可以产生不同的效应，具有细胞特异性和疾病特 异性。

3.2 Nec-1 的保护作用

由于程序性坏死在许多非肿瘤性疾病的发生和发展过程中起着“推波助澜”的作用，Nec-1 作为其特异性抑制剂能够在许多疾病中发挥保护作用。在心血管系统疾病中，Nec-1 能显著缩小小鼠心肌梗死模型的梗死面积，起到心肌保护作用[32]。在神经系统疾病中，以脑出血为例，Nec-1 可以改善小鼠脑水肿、减少颅内损伤以及提高脑神经功能[33-34]。Nec-1 还可以在急性肝衰竭、急性肾衰竭和缺血再灌注等疾病模型中发挥保护作用，缓解疾病进展，提高小鼠的生存期和疾病预后。

除了程序性坏死和凋亡，Nec-1 也可以通过作用于ROS 通路发挥其保护作用。由于ROS 通路位于RIPK1 下游，应用Nec-1 可以降低疾病状况下急剧升高的ROS 水平。在小鼠心肌收缩功能障碍模型中，应用Nec-1 能显著抑制ROS 的生成[35]；在缺氧引起的细胞损伤中，Nec-1能够提高细胞活性，抑制ROS 生成及其对细胞的损伤[36]；在急性肝衰竭小鼠模型中，Nec-1 不仅能够缓解线粒体功能障碍，抑制肝细胞胞内ROS 的生成，还能缓解胞外ROS 引起的肝细胞损伤[37]。虽然Nec-1 降低ROS 水平的具体机制还不是很清楚，但可以确定的是RIPK1 的激活在ROS 相关通路中发挥至关重要的作用。因此应用Nec-1不仅能阻断RIPK1-RIPK3-MLKL 通路，还能抑制RIPK1下游的ROS 通路，从而在多种疾病中发挥保护作用。

4 结语与展望

作为一种新发现的细胞死亡方式，程序性坏死及其在疾病中的作用近年来受到越来越多的关注，逐渐成为研究热点。本文综述了目前程序性坏死在多种疾病中的不同作用，并且提出了对应的治疗策略。在肿瘤疾病中，程序性坏死能介导肿瘤细胞死亡，发挥抗肿瘤作用，因此在肿瘤细胞中诱导程序性坏死可能成为治疗肿瘤的新靶点；而在其他疾病（如炎症性疾病）中，程序性坏死能引起细胞死亡和组织损伤，因而抑制程序性坏死可以缓解疾病。所以，进一步研究程序性坏死的机制，寻找或研发特异性诱导剂和抑制剂，使之应用于临床研究，有望成为疾病治疗的新策略。

参·考·文·献

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