生防菌Bacillus safensis的鉴定及其对核桃病原菌的抑菌特性

张知晓，户连荣，刘 凌，季 梅

(云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201)

核桃(Juglansregia)学名胡桃，是多年生落叶乔木，核桃仁是高档坚果，其种壳能开发成工艺品，木材是制作高档家具的原料，叶子及果皮可以入药。因核桃具有良好经济社会价值，云南省将核桃作为发展八大产业的重要物种之一及打造云南“绿色食品牌”的重要组成部分[1]。近些年来，核桃的种植面积快速增加，有数据显示，截至2017年，云南省核桃种植面积达286.67万hm2，核桃(干果)总产量为115万t，产值318亿元，居全国首位[2]。但核桃病虫害发生较严重。在云南省，核桃黑斑病、炭疽病、枝枯病及根腐病等发生普遍，对核桃生产造成了严重影响[3]。目前，防治病害仍然依赖化学药剂，鉴于人们对绿色无公害食品需求以及生态环境保护意识的提高，生物防治成为核桃病害防治的重要发展方向之一。

芽孢杆菌具有抗逆能力强、抑菌谱广的特点，近些年研究较多的如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)等，在由丝状真菌引起的植物病害的生防领域有广泛应用[4]。而芽孢杆菌资源丰富，还有许多具有生防效果的种类等待发掘研究。芽孢杆菌抑菌谱广泛，但不同菌株对不同病原菌抑制效果不一，且不同芽孢杆菌抑制病原菌的作用机制不同[5]，因此，在发掘新生防菌资源的同时，有必要对其抑菌特性进行研究。鉴于此，选用前期试验分离验证的具有抑菌效果的1株生防细菌7-3，对其进行分类鉴定，并测定其对核桃主要真菌病害的抑菌特性，为开发新的生防微生物资源及将生防微生物菌株应用于核桃病害防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试生防菌 菌株7-3由云南省林业和草原科学院核桃有害生物绿色防控技术集成与产品开发项目组，于2019年4月在云南省昆明树木园(东经102°44′48″、北纬25°8′39″)核桃根际土壤中分离筛选得到。

1.1.2 供试病原菌 病原菌7株，均为前述项目组前期分离鉴定的病原菌：链格孢菌(Alternariaalternate)，菌株编号B1；胡桃叶点霉菌(Phyllostictajuglandis)，菌株编号B2；间座壳菌(Diaporthenobilis)，菌株编号B3；镰孢菌(Fusariumsp.)，菌株编号B4；胡桃楸拟茎点菌(Phomopsisjuglandina)，菌株编号B5；胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)，菌株编号B6；广布拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)，菌株编号B7。

1.1.3 供试培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH值自然，用于生防细菌培养及形态鉴定。

PDA培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH值自然，用于病原真菌培养及对峙培养。

1.2 试验方法

1.2.1 生防细菌鉴定 形态观察：将菌株7-3在LB固体培养基上划线培养，在37 ℃恒温培养箱中培养48 h后观察菌落生长情况，并用革兰氏染色法制片完成细胞形态结构的显微观察[6]。

生理生化特性鉴定：完成菌株温度(5～60 ℃)、pH值(4.0～13.0)、NaCl(0～12%)耐受试验，测定其水解淀粉和明胶能力，用葡萄糖、麦芽糖、乳糖等碳源及硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等氮源进行唯一碳氮源的生长试验[7]。

16S rRNA序列测定：采用DNA提取试剂盒按照操作说明提取菌株的基因组总DNA，用细菌通用引物27F/1492R扩增16S rRNA片段，用1%琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送深圳华大基因有限公司进行测序。将获得的基因序列与GenBank中已知的核酸序列进行BLAST比对，选取相关近缘种序列用MEGA 4.1软件进行系统发育分析，采用邻接距离法构建系统发育树[8]。

1.2.2 生防菌对核桃主要病原真菌拮抗功能评价 采用平板对峙试验测试生防菌株7-3发酵液对7种病原菌的抑菌效果。用5 mm的打孔器沿菌落边缘选取新鲜的菌丝制成菌饼，单个菌饼接种在PDA培养基平板中央，用移液器吸取50 μL生防菌发酵液，均匀对称地接种在距菌饼中央30 mm处的4个点，以接无菌水为对照(CK)。于 28 ℃下培养，每个处理3次重复。待对照组菌落长满平板后，分别测量对照菌落半径(R)、处理菌落半径(r)，计算抑制率。抑制率=[(R-r)/(R-2.5)]×100%。

1.2.3 生防菌对核桃主要病原菌孢子的影响 试验采用随机区组设计，共4个处理：活体发酵液处理、发酵滤液处理、发酵灭菌滤液处理、对照(CK)，每个处理重复3次。其中，活体发酵液：将菌株7-3接种于PDA培养液，28 ℃、140 r/min摇床培养24 h，将菌液稀释为2×109cfu/mL的活体菌液；发酵滤液：将2×109cfu/mL的活体菌液用细菌滤器过滤3次后的滤出液；发酵灭菌滤液：将2×109cfu/mL的活体菌液经121 ℃灭菌20 min后，用细菌滤器过滤1次的滤出液；对照：121 ℃灭菌20 min的灭菌自来水。

病原菌孢子悬浮液制备：用无菌水冲洗PDA培养基上培养5 d的广布拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)分生孢子，离心沉淀分生孢子。反复清洗3次后，配制成4×106个/mL的孢子悬浮液。

混合培养观察：将分生孢子悬浮液分别和上述4个处理的液体按1∶1混合，置于离心管中，28 ℃、140 r/min摇床黑暗恒温培养，分别于12、24 h后，用无菌移液器吸取病原菌孢子，在光学显微镜下观察其形态，并拍摄照片。

2 结果与分析

2.1 核桃病原菌生防细菌鉴定

2.1.1 菌株形态鉴定 如图1，将菌株7-3在固体LB培养基上划线培养3 d后，其菌落为淡黄色，边缘呈波浪状，表面粗糙，中央无凸起，干燥。显微镜下观察到菌株菌体直杆状，单个，两端钝圆，革兰氏染色呈阳性。

A：在固体培养基上的菌落形态；B：革兰氏染色结果

2.1.2 生理生化鉴定 菌株生理生化特征检测结果(表1)显示，该菌株能利用葡萄糖、麦芽糖、核糖、甘油、蔗糖、甘露醇、D-果糖、D-核糖和海藻糖作为唯一碳源进行生长，能利用硝酸铵、氯化铵、酪氨酸、组氨酸作为唯一氮源进行生长，生长温度在10～50 ℃，生长pH值在5.0～9.0，能耐受10%的NaCl，具有水解明胶的能力，不能水解淀粉。

表1 生防菌株7-3的生理生化特性

2.1.3 16S rRNA序列测定及系统发育学分析 利用16S rRNA通用引物，以菌株7-3 DNA 为模板进行PCR扩增，测序得到了长度为1 372 bp 的16S rRNA基因片段(登录号：MT378305)。将测序获得的序列在NCBI上进行核苷酸同源性比对，结果显示，其与沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)的16S rRNA核苷酸序列同源性最高，达到100%。选取其相关近缘种，采用邻接距离法构建系统发育树，结果(图2)显示，菌株7-3与沙福芽孢杆菌同聚一支，亲缘关系最近。结合形态及生理生化试验结果，初步鉴定菌株7-3为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)。

图2 生防菌株7-3的16S rRNA系统发育树

2.2 核桃病原菌生防细菌拮抗功能评价

菌株7-3对7株核桃病原真菌均表现出不同程度的抑制作用(图3)，对链格孢菌(Alternariaalternate,B1)、胡桃叶点霉菌(Phyllostictajuglandis,B2)、间座壳菌(Diaporthenobilis,B3)、镰孢菌(Fusariumsp.,B4)、胡桃楸拟茎点菌(Phomopsisjuglandina,B5)、广布拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata,B7)的抑制率在50%以上，抑制效果十分明显。其中，对间座壳菌(Diaporthenobilis,B3)的抑制率最高，达到82.9%(图4)。在所测植物病原真菌中，菌株7-3对胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes,B6)的抑制率最低，仅为47.5%。

2.3 生防细菌对核桃病原菌分生孢子萌发的影响

观察培养12 h后的孢子萌发情况(图5)，发现对照的孢子开始萌发，孢子第3色胞略微膨大变圆，产生粗细均匀的芽管和菌丝。加入活体发酵液处理的拟盘多毛孢菌(P.disseminata)孢子严重畸形，孢子第3色胞和基部无色胞膨大变形，且基部无色胞多呈囊泡状；加入发酵滤液处理的孢子不萌发，孢子第3色胞膨大变形明显；加入发酵灭菌滤液处理的孢子几乎不萌发，孢子第3色胞膨大变形明显。

A：12 h后活体发酵液孢子形态；B：12 h后发酵滤液孢子形态；C：12 h后发酵灭菌滤液孢子形态；D：12 h后对照孢子形态；E：24 h后活体发酵液孢子形态；F：24 h后发酵滤液孢子形态；G：24 h后发酵灭菌滤液孢子形态；H：24 h后对照孢子形态

观察培养24 h后的孢子萌发情况发现，对照的病原菌已经形成浓密的菌丝团，菌丝生长粗细均匀，排列整齐，菌丝表面光滑透明，内部物质分布均匀。加入活体发酵液处理的细菌黏附在病原菌拟盘多毛孢菌(P.disseminata)孢子周围，病原菌孢子分散，第3色胞和基部无色胞体壁破裂乃至溶解，胞质外泄，活体菌群的大量黏附，加大了病原孢子畸形及破裂的程度；加入发酵滤液处理的孢子聚集成团，均不萌发，孢子第3色胞变形严重，且呈囊泡状畸形；加入发酵灭菌滤液处理的孢子能够萌发，但萌发率降低，萌发形成菌丝团，与正常菌丝相比，整体粗短，排列杂乱，孢子形成菌丝处瘤状突起，末端出现异常分枝，菌丝不能正常生长，表明其抑菌能力具有高度稳定性。

3 结论与讨论

经过前期生防菌的筛选，发现菌株7-3对病原真菌有良好的抑菌效果，通过生理生化、形态观察和分子生物学相结合的方法，将菌株7-3鉴定为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)。沙福芽孢杆菌在许多方面具有应用价值，如用于发酵获得新型纤溶酶[9]、果胶酶[10]、细胞外RNase[11]及角蛋白酶[12]等，而其产生的木聚糖酶以及丝氨酸碱性蛋白酶分别在造纸工业[13]及洗涤剂工业[14]中具有广阔的应用前景，该菌还被用于发酵生产生物表面活性剂[15]，制备调味品香兰素[16]，其生物合成的聚羟基丁酸酯(PHB)，可被用于制造生物降解塑料[17]。该菌在油田防腐蚀领域[18]、废水处理[19]及碳汇领域的应用[20]都有报道。在农业领域，沙福芽孢杆菌被报道具有促进植物生长[21]、修复有毒微量元素[22]、石油[23]及农药[24-25]造成的土壤污染的作用。其中，生防方面已有研究显示，沙福芽孢杆菌对番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)[26]、烟草黑胫病(Phytophthoraparasitica)[27]、硫酸盐还原菌SRB[18]、细菌性枯萎病(Pseudomonassp.)[28]、水稻稻瘟病(Magnaportheoryzae)[29]、巴氏丝核菌(Rhizoctoniabataticola)[30]等多种病原真菌及细菌均有一定的抑制活性，此外，还有学者对其杀虫[31]及诱导植株抗性[32]的能力进行了研究。

目前，核桃病害的防治仍以化学防治为主，搭配育种及修枝、清落叶等营林措施[33]，其中化学农药难免对生态环境造成破坏，育种及营造健康林均需要漫长周期，生物灾害突发时难以应对。生物防治技术因其见效快，对生态环境友好，满足食品安全需求的优点，近几年发展迅速。本研究中，菌株7-3能对链格孢菌(Alternariaalternate)、胡桃叶点霉菌(Phyllostictajuglandis)、间座壳菌(Diaporthenobilis)、镰孢菌(Fusariumsp.)、胡桃楸拟茎点菌(Phomopsisjuglandina)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)和广布拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)7种核桃病原真菌产生抑菌作用，结合前人的相关研究，认为沙福芽孢杆菌是一种潜力生防菌，抑菌能力强，抑菌谱广。RONG等[29]对沙福芽孢杆菌的抑菌物质进行分析，证实iturin A2和iturin A6 可改变菌丝膜的通透性。本研究结果显示，菌株5-1经液体发酵后能够使病原菌分生孢子及菌丝畸形，进而抑制其萌发及生长，菌群黏附性强，且抑菌能力稳定，这些特征表明其在核桃生防领域具有广阔的应用开发前景。然而关于该菌株的研究才刚刚起步，要将其应用于核桃病害的生物防治还需对其代谢途径、功能机制等进行深入研究，同时还要开展大量的田间防效试验。