咳嗽变异性哮喘患儿NGF、NKA、SP表达与Th1/Th2细胞因子的相关性分析

张卜元，范静华

(西安医学院第二附属医院儿科，西安 710038)

咳嗽变异性哮喘(CVA)是临床上常见的呼吸道疾病，在儿童中发病率较高，患者以慢性咳嗽为主要临床表现，并具有哮喘的气道炎症和气道高反应性的病理特征，疾病呈慢性发展，部分患者最终可进展为典型哮喘[1]。CVA的气道高反应性与气道敏感性增高有关，气道敏感性增高与炎性细胞数目增加、上皮损伤、气道炎症及神经细胞等活动有关[2]。神经生长因子(NGF)对于控制气道神经源性炎症具有重要作用，有研究[3]显示其参与了哮喘疾病的发展。感觉神经和副交感神经中含有多种神经肽，包括神经激肽A(NKA)、P物质(SP)，这些神经肽在支气管血液中广泛存在，并与呼吸道炎症、支气管收缩、黏液分泌等有着密切关系[4]。随着研究的深入，许多研究[5-6]发现辅助性T淋巴细胞(Th1和Th2)及其分泌的细胞因子平衡失调也是导致CVA发生发展的重要原因。而NGF、NKA及SP表达与Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子之间是否存在联系目前研究较少。因此，本研究对CVA患儿及正常儿童的NGF、NKA及SP表达与Th1/2细胞及其细胞因子的相关性进行了分析，以期为CVA的发病机制及临床诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取西安医学院第二附属医院2018年9月至2019年9月收治的80例CVA患儿作为研究组，纳入标准：1)符合《咳嗽的诊断与治疗指南》[7]中CVA的诊断标准，并经临床检查确诊；2)患儿家属均知情且自愿参与，签署知情同意书；3)患儿年龄3～15岁，且在最近3个月以内未接受支气管扩张或者激素治疗。排除标准：1)有严重肾、心脏、肝或造血系统疾病病史；2)同时患有其他肺部疾病，如肺结核、支气管扩张症等；3)入组前曾在他院接受过治疗；4)存在无法全程配合该项目研究可能性；5)有严重精神障碍。其中男43例，女37例；年龄3～15岁，平均(8.2±1.4)岁。另选取同期在本院进行健康体检的正常儿童80例作为对照组，其中男45例，女35例，年龄3～14岁，平均(7.8±1.3)岁。2组研究对象的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会审核批准。

1.2 检测方法

1.2.1 支气管诱导痰上清液(BALF)炎性细胞检测

诱导前10 min，给受试者吸入雾化3%的高渗盐水、沙丁胺醇400 μg，随后收集痰液，将痰液加入到4倍体积的0.1%二硫苏糖醇中进行水浴，水浴后离心处理，提取上清液，对炎性细胞计数进行检测。

1.2.2 NGF、NKA及SP测定

于清晨空腹抽取5 mL静脉血，3000 r·min-1离心10 min取血清，-80 ℃保存待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测NGF、NKA及SP水平，试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.2.3 神经源性相关炎症因子测定

于清晨空腹抽取5 mL静脉血，3000 r·min-1离心10 min取血清，-80 ℃保存待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素5(IL-5)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9，试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，所有操作严格依照试剂盒说明书进行。

1.2.4 Th1/Th2细胞及相关细胞因子测定

于清晨空腹抽取5 mL静脉血，3000 r·min-1离心10 min取血清，-80 ℃保存待测。采用流式细胞术检测外周血Th1和Th2细胞浓度。采用ELISA法测定血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、IgG、IgE水平，实验中各血清细胞因子试剂盒均来自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析，数据经过整齐性检验，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验；相关性分析采用Spearman检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 支气管诱导痰炎性细胞水平

研究组巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数均显著低于对照组，嗜酸性粒细胞及细胞总数均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 2组支气管诱导痰上清液炎性细胞水平比较

2.2 血清NGF、NKA及SP水平比较

研究组血清NGF、NKA、SP水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 2组血清NGF、NKA及SP水平比较

2.3 血清神经源性相关炎症因子水平

研究组血清TNF-α、IL-5、MMP-2、MMP-9水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 2组血清神经源性相关炎症因子水平比较

2.4 Th1/Th2细胞及相关细胞因子水平比较

研究组Th1细胞数、Th1/Th2、IL-2水平、IFN-γ水平均显著低于对照组，Th2细胞数、IL-4水平、IL-10水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 2组Th1/Th2细胞及相关细胞因子水平比较

2.5 相关性分析

相关性分析结果显示，NGF、NKA及SP与Th1/Th2(r=-0.354、-0.457、-0.502，均P<0.01)、IL-2(r=-0.493、-0.398、-0.376，均P<0.01)、IFN-γ(r=-0.506、-0.385、-0.489，均P<0.01)呈显著负相关，与IL-4(r=0.437、0.382、0.455，均P<0.01)、IL-10(r=0.396、0.508、0.449，均P<0.01)呈显著正相关。

3 讨论

CVA的发病机制与呼吸道炎症有着显著关系，其中存在大量炎性细胞参与，并导致气道黏膜增厚，引发呼吸道狭窄，使患者出现咳嗽、呼吸困难等临床表现。有研究[8]显示，嗜酸性粒细胞活性增强可促进和释放多种炎性介质的表达，并参与了损伤气道上皮细胞的介导反应。嗜酸性粒细胞浸润程度是判断气道炎症严重程度的重要判断指标。CVA、哮喘等均为嗜酸性粒细胞浸润的慢性气道炎症反应[9]。本研究结果显示，CVA患儿诱导痰液上清液中性粒细胞数显著低于正常儿童，嗜酸性粒细胞数显著高于正常儿童，提示CVA患儿气道症状与嗜酸性粒细胞浸润及中性粒细胞减少有关。

有研究[10]显示，神经-受体机制参与了CVA患者呼吸道高反应性及炎性细胞产生。反复咳嗽和呼吸道反应增高长时间刺激机体同一感受器，促使气道狭窄、咳嗽等症状逐渐加重。NGF主要由神经元和其他神经细胞产生，有研究[11]指出，NGF在慢性咳嗽患者气道反应的控制和维持中具有重要作用。NKA、SP为气道内非肾上腺素能非胆碱能神经系统(NANC)感觉神经元释放的具有不同生物活性的感觉神经肽，NKA、SP可促进血管通透性增加，引发血浆渗出、组织水肿等病理改变[12-13]，在CVA患者中表现为气道神经源性炎症。本研究结果显示，CVA患儿NGF、NKA、SP水平显著高于正常儿童，提示CVA患儿NGF、NKA、SP水平增加促使嗜酸性粒细胞浸润、中性粒细胞减少，诱导炎性细胞因子释放，加重气道炎症反应，表明NGF、NKA、SP参与了CVA患儿咳嗽、验证过程和气道高反应性的发展过程。NGF具有高效调控神经肽的作用，因此其在哮喘发病机制中的作用引发关注。NGF可以诱导神经细胞促进速激肽受体表达和速激肽生成，从而可诱导和促进神经源性炎症的发生发展。本研究认为其主要的机制为：NGF能够上调气道内神经肽的产生，促使神经肽类物质数量和类型的改变。NKA、SP与咳嗽敏感性存在明显相关性，炎性状态下CVA患者呼吸道NGF产生明显增加，其诱导NKA、SP水平随之上升，从而增强炎性细胞活性，放大气道炎症。嗜酸性粒细胞胞膜可以大量表达NGF受体并促进NGF水平的上升，CVA患儿嗜酸性粒细胞数目增加，加重炎症反应，并进一步刺激NGF的表达释放，形成恶性循环，导致咳嗽敏感性和气道神经源性炎症增强。本研究中，研究组TNF-α、IL-5、MMP-2、MMP-9水平均显著高于对照组。提示，由于CVA患儿机体NGF、NKA、SP水平异常升高导致气道炎症反应慢性进展，促使TNF-α、IL-5等炎症因子水平明显增加。

有研究[14-15]指出，哮喘、CVA等疾病患者机体存在不同程度的免疫功能异常，这与Th1/Th2细胞比例异常及功能失衡等有着明显关系。本研究结果显示，CVA患儿Th1细胞数显著低于对照组，Th2细胞数显著高于对照组，Th1/Th2显著低于对照组，并且CVA患儿IL-2、IFN-γ水平显著低于对照，IL-4、IL-10水平显著高于对照组。提示CVA患儿Th1/Th2细胞因子失衡，导致机体免疫力降低，并与CVA的病情进展和反复发作关系密切。本研究中，相关性分析结果显示，NGF、NKA及SP与Th1/Th2、IL-2、IFN-γ显著负相关，与IL-4、IL-10显著正相关。提示CVA患儿NGF、NKA及SP异常升高与患儿Th1/Th2细胞因子失衡存在相关性。Th1分泌IFN-γ对于IgE合成具有促进作用，Th2分泌的IL-4对于IgE合成具有正调节作用，IL-2、IFN-γ水平降低和IL-4、IL-10水平增加可刺激机体产生大量嗜酸性细胞、炎症介质、IgE等，IgE介导机体出现I 型变态反应，从而导致气道高反应性、支气管痉挛和哮喘反复。王豪等[16]研究显示，变应性鼻炎患者NGF等神经营养因子mRNA的表达量上调并影响Th1/Th2细胞平衡，从而导致变应性鼻炎疾病发展。因此本研究推测，NGF、NKA及SP可诱导神经源相关炎性介质的合成和释放，加重CVA患儿气道炎性反应，促使炎性细胞和免疫细胞活性改变和平衡失调，从而导致Th1/Th2细胞因子水平改变；同时，Th1/2细胞失衡也导致机体炎性应激加剧，嗜酸性细胞合成和释放NGF等水平增加，促进CVA病情发展；并且，Th1/Th2细胞失衡促使机体免疫力降低，导致机体抑制炎性发展的能力减弱，从而促进了NGF、NKA及SP的水平升高。

综上所述，CVA患儿存在明显的Th1/Th2细胞相关细胞因子失衡，炎症因子水平急增，通过NGF、NKA及SP检测可有助于了解CVA患儿病情变化及免疫功能失衡情况。