银纳米线与氧化石墨烯复合物的制备及其抗菌性能研究

朱兰芳，陈鹏鹏，毛昌杰

(安徽大学 化学化工学院，安徽 合肥 230601)

随着社会的发展，人们日益关心饮用水的质量，水的质量直接影响着人的健康.而饮用水中往往存在很多微生物，其中最常见的是大肠杆菌，它可在水中快速大量繁殖，通过饮水进入人体胃肠道，造成越来越多的疾病.目前，常用于清洁饮用水的消毒剂有氯、二氧化氯或臭氧等，它们通过抑制饮用水中微生物的生长进而起到抗菌的作用.但其残留物及消毒副产物有较强的毒性，这些物质属于潜在致癌物，给饮用者带来一定的健康风险.而纳米银作为一种常用的抑菌材料，因其独特的抑菌性能和抑菌机制，被应用于多个领域，如建材、环境净化、医疗、医药、化妆品、纺织品等领域.通过不同的制备方法，可以制备出立方体、球形、棒状、锥状和丝状的银纳米材料.其中线状的银纳米材料(AgNWs)比表面积大，吸附能力强，可吸附在细胞膜上，破坏细胞膜并使其内容物外流，导致细菌死亡.这是目前AgNWs被普遍接受的一种抗菌机制.若将制备的银纳米材料直接混于水体，用量较大，不适合大规模应用.为克服这一缺点，笔者将银纳米材料与氧化石墨烯(GO)进行复合进而提高材料的杀菌性能.

在制备的GO/AgNWs复合材料中，GO的加入增加了AgNWs对大肠杆菌的吸附，提高其杀菌性能，还为其提供新的杀菌机制；同时，AgNWs又可提高GO光电子-空穴对的分离效率，增强GO的光致活性氧杀菌作用.在光照条件下，由于二者的相互作用，可以极大地提高复合材料杀菌性能.

笔者以GO/AgNWs复合材料作为抗菌材料，采用平板计数法、激光扫描荧光显微镜、电子自旋共振(ESR)、扫描电子显微镜和光电化学技术等探究了GO/AgNWs对大肠杆菌的杀菌性能和杀菌机制.

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

试剂：石墨粉(99.995%)、KMnO、乙二醇均购自上海化学试剂有限公司；HSO(98%)、硝酸银购自国药控股化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)购自阿拉丁实业股份有限公司；氯化钠购自天津大茂化学试剂厂；实验采用双蒸馏水；2.5%戊二醛溶液由上海源叶生物技术有限公司提供；乳糖胆汁发酵液(LB)培养基由北京路桥科技有限公司提供.

主要仪器： FA1004N的电子天平，上海精学科学仪器有限公司； KQ2200DE的超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；90-1B的磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司；DGT-G80的电热鼓风干燥箱，合肥华德利科学器材有限公司；H/T16MM的高速离心机，湖南赫西仪器有限公司.

1.2 实验步骤

笔者采用Hummers法合成了GO.GO/AgNWs的合成：首先将0.8 g PVP溶于20 mL乙二醇中搅拌1 h；然后将0.679 4 g的硝酸银溶解在20 mL的乙二醇中，搅拌30 min；再将2 mL 0.006 mol·L氯化钠和0.3 g GO加入制备的PVP溶液和硝酸银溶液的混合溶液中搅拌均匀；最后，将上述搅拌均匀的溶液倒入100 mL反应物中在160 ℃下反应2.5 h；得到的固体用去离子水洗涤几次，然后冷冻干燥得到GO/AgNWs复合材料.同样，通过改变加入的氧化石墨烯的量，分别制备了GO含量为0%，40%，60%，80%，100%的GO/AgNWs复合材料.图1为GO/AgNWs复合材料合成的步骤示意图.

图1 GO/AgNWs合成过程

1.3 抗菌实验

LB液体培养基的配制：取3.5 g乳糖胆盐发酵培养基粉末，溶于100 mL去离子水中.LB固体培养基的配制：取3.5 g乳糖胆盐发酵培养基粉末和1.5 g琼脂粉，溶于100 mL去离子水中.配制好的液体培养基和固体培养基均在高压灭菌锅中于121 ℃下灭菌21 min后放入温度设定为60 ℃的烘箱中以用于后面的一系列实验.抗菌实验中所用到的所有仪器均需灭菌后使用.

扩菌培养：首先从冰箱中取出一定量的菌种解冻，然后将已灭过菌的液体培养液从烘箱中拿出放在操作台上冷却至室温，取25 μL已解冻的菌种加入冷却至室温的液体培养基中，将盛有液体培养基和大肠杆菌的锥形瓶放入温度设置在37 ℃、转速设置在220 r·min的摇床中震荡培养12 h，将扩大培养的大肠杆菌留作后面的抗菌实验.

抗菌实验：首先将实验中用到的所有仪器在超净工作台上灭菌25 min,在已灭菌的超净工作台上取1 mL已制备好的样品溶液与80 μL的细菌悬浮液均匀混合，加入30 mL的LB液体培养基中，在搅拌器上均匀搅拌.以10 W的LED灯为光源，在光照下样品与细菌接触30 min后，对大肠杆菌悬浮液进行连续稀释.然后，取50 μL不同浓度的菌液分别涂布在LB琼脂板上，在37 ℃的生物培养箱中倒板孵育24 h，利用菌落计数法计数.对照组使用未加入样品的无菌消毒水，用同样的检测方法检测菌落数.

1.4 测定活性氧种类(ESR法)

2 结果与讨论

2.1 结构与形貌表征

GO，AgNWs，GO/AgNWs的形貌、物相及光谱分析结果如图2～3所示.

图2 GO(a,d)，AgNWs(b,e)，GO/AgNWs复合材料(c,f)的SEM图像及TEM图像

图3 GO，AgNWs，GO/AgNWs的FT-IR吸收光谱(a)、XRD(b)； GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)的UV-Vis光谱(c)

在图2(a)中，GO的层结构上有明显的褶皱，这是片状GO的典型特征.同时，从图2(d)可以看出，氧化石墨烯的平面片状结构较好，没有明显的杂质，说明该实验制备的氧化石墨烯具有较高的分散性和清洁度.制备的银纳米线如图2(b)和(e)所示，在图2(c)和图2(f)中可以看到AgNWs均匀地分布在GO上.

由图3(c)的GO，AgNWs，GO/AgNWs的UV-Vis光谱图可观察到GO/AgNWs对光的吸收范围比纯的GO和AgNWs均有所扩大，发生了蓝移.说明GO/AgNWs可以吸收更大范围的光，进而提高其光催化性能.

为了进一步研究复合材料的组成，分别对GO，AgNWs，GO/AgNWs进行了X射线光电子能谱分析，结果如图4所示.

图4 GO，AgNWs，GO/AgNWs的XPS谱图(a)；GO/AgNWs的Ag3d XPS光谱(b)

2.2 GO/AgNWs复合材料的抗菌性能

以大肠杆菌为实验菌株在LB琼脂板上培养，利用平板计数法对GO，AgNWs和不同配比的GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)的抗菌性能进行研究，结果如图5所示.

图5 在黑暗(D)和光照(L)条件下GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4,0.6和0.8)处理的大肠杆菌的生长状况(a)及存活率(b)

图5(a)显示，GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)均有一定的抗菌效果，且样品在有光照时对大肠杆菌的抗菌性能均比没有光照时高.由图5(b)可观察到复合材料GO/AgNWs的抗菌效果明显比纯的GO和AgNWs高，而纯的AgNWs的抗菌性明显高于纯的GO，这说明GO/AgNWs复合材料的抗菌作用主要来自AgNWs，且复合材料GO/AgNWs在GO与AgNWs配比为0.4时抗菌效果最佳.

利用激光共聚焦显微镜观察大肠杆菌的荧光活/死细胞，进一步验证GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)的抗菌效果，实验中用到的碘化丙啶(PI)是一种红色荧光染色剂，对活的细胞膜不透光，只能标记受损的细胞膜，在激发波长为535 nm的条件下大肠杆菌的光学图像和荧光图像如6所示.

(a)和(f)、(b)和(g)、(c)和(h)、(d)和(i)、(e)和(j)分别是GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)在可见光照射下处理的大肠杆菌.图6 GO，AgNWs，GO/AgNWs处理后的大肠杆菌的光学图像((a)～(e))和荧光图像((f)～(j))

图6(a)～(e)光学图像中的阴影点与图6(f)～(g)荧光图像中的红色荧光点位置是相对应的.图6(f)～(j)中的红色荧光点代表着死亡的大肠杆菌，在图6(f)和(g)中可观察到少量的红色荧光点，而在图6(h)～(g)中可观察到大量的荧光点，且图6(h)的红色荧光点最多，再次证明了复合材料GO/AgNWs的抗菌效果明显强于纯的GO和AgNWs，且复合材料GO/AgNWs在GO与AgNWs配比为0.4时抗菌效果最佳.其染色结果与上述平板菌落计数法的结果基本一致.

2.3 膜损伤机制研究

在LED下光照20 min后，经GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)分别处理的大肠杆菌的SEM图像，如图7所示.

(a) GO；(b) AgNWs；(c) GO/AgNWs(0.4)；(d) GO/AgNWs(0.6)；(e) GO/AgNWs(0.8)图7 在20 min光照下各样品处理的大肠杆菌的SEM图像

由图7可清晰地观察到大肠杆菌的微观形态.活的无破损的大肠杆菌呈两端钝圆的杆状.无活性的大肠杆菌表面出现褶皱和孔洞.图7(a)～(e)均显示大肠杆菌表面有褶皱和孔洞，说明GO，AgNWs，GO/AgNWs(0.4，0.6，0.8)均对大肠杆菌的细胞膜有所破坏，尤其是图7(b)～(c)的大肠杆菌表面出现大面积褶皱和孔洞，表明AgNWs可损伤大肠杆菌的细胞膜，致使其内容物流出，导致细胞死亡.

2.4 生成的的检测

检测时室温为298 K，物料初始浓度为0.5 mg·mL-1.图加成物(a)、[DMPO-OH]·加成物(b)、TEMPO(c)的ESR谱

2.5 光催化杀菌机制

在光照条件下，半导体物质会吸收能量产生电子跃迁，电子由价带跃迁到导带，此时产生光生电子-空穴，光生电子持续传递，则产生电流.为了验证GO/AgNWs复合材料的光催化杀菌机制，分别测量GO，AgNWs，GO/AgNWs复合材料在可见光照射下的光电流响应图谱；利用EIS系统研究光生电子-空穴在光致材料中的迁移和转移，一般来说，电弧半径越小，电荷转移效率越高.结果如图9所示.

图9 GO，AgNWs，GO/AgNWs的光电流响应(a)和EIS光谱(b)

由图9(a)可观察到，AgNWs几乎无电流响应，而GO和GO/AgNWs均有电流响应，且GO/AgNWs复合材料产生的光电流响应最强.这一结果表明，AgNWs的加入，大大提高了电子空穴对的分离率，使得复合材料的抗菌效果显著增强.由图9(b)可以观察到GO/AgNWs复合材料的半圆半径小于GO和AgNWs的半圆半径，说明AgNWs的加入使GO/AgNWs复合材料具有更快的界面电荷转移和更高的电子空穴对分离效率，从而进一步提高了GO/AgNWs的杀菌效果.

图10 光照条件下GO/AgNWs复合材料抗菌的机制

3 结束语

(1) 笔者通过Hummers法合成了GO，利用还原法成功制备了GO/AgNWs纳米抗菌材料，并利用SEM，TEM，XRD，FT-IR，UV-Vis，XPS对样品进行了详细的表征.

(2) 利用平板计数法、ESR、光电流测试和EIS光谱探究了GO/AgNWs复合材料的抗菌性能，结果显示GO/AgNWs具有较高的抗菌活性.GO/AgNWs通过膜损伤和氧化应激两个层面对细菌进行灭活，GO因具有超薄的二维空间结构，可有效防止纳米银的团簇，从而提高材料的整体抗菌性能.AgNWs的加入可加速GO光生电子-空穴对的快速分离，产生更多的活性氧，促进GO的光致杀菌作用.