miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌肿瘤干细胞生物学行为影响

席孝忠 李国强 肖雷 姚坤厚

[摘要] 目的 探究miR-21-5p調控成纤维细胞生长因子18（FGF18）表达对结肠癌肿瘤干细胞生物学行为作用及机制。

方法 应用流式细胞分选术筛选CD133+/CD44+结肠癌干细胞，并行细胞培养、分组及质粒转染。分别应用CCK-8法、Transwell小室法、流式细胞术检测细胞增殖、迁移和侵袭能力及凋亡率。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-21-5p及FGF18 mRNA表达水平，Western blotting检测CD44、CD133和FGF18蛋白表达水平。

结果 FGF18为miR-21-5p靶基因。与空白（Blank）组和阴性对照（NC）组相比，miR-21-5p模拟物（miR-21-5p mimic）组CD133+/CD44+细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低，迁移、侵袭能力显著提升，CD44、CD133和FGF18表达水平显著上升（F=11.23～886.10，P均<0.05）;miR-21-5p抑制剂（miR-21-5p inhibitor）组和FGF18沉默表达（si-FGF18）组细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高，迁移、侵袭能力显著降低，CD44、CD133和FGF18表达水平显著下调（F=10.23～764.70，P均<0.05）;而si-FGF18+miR-21-5p mimic组与Blank组和NC组比较差异无统计学意义（P均>0.05）。

结论 下调miR-21-5p表达并沉默FGF18表达，可抑制结肠癌肿瘤干细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡。

[关键词] 结肠肿瘤;肿瘤干细胞;微RNAs;基因，FGF18;基因沉默;细胞增殖;细胞凋亡;细胞运动

[中图分类号] R735.35;R342.2

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0886-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.191

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211229.1628.004.html;2021-12-30 14：25：24

EFFECT OF MIR-21-5P ON THE BIOLOGICAL BEHAVIOR OF COLON CANCER STEM CELLS BY REGULATING THE EXPRESSION OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR 18

XI Xiaozhong， LI Guoqiang， XIAO Lei， YAO Kunhou

（Department of Oncological Surgery， Xinyang Central Hospital， Xinyang 464000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of miR-21-5p on the biological behavior of colon cancer stem cells by regulating the expression of fibroblast growth factor 18 （FGF18） and related mechanism.

Methods Flow cytometry sorting was used to screen out CD133+/CD44+ colon cancer stem cells， and cell culture， grouping， and plasmid transfection were performed. CCK-8 assay， Transwell chamber assay， and flow cytometry were used to measure cell proliferation/migration/invasion abilities and cell apoptosis. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of miR-21-5p and FGF18， and Western blotting was used to measure the protein expression levels of CD44， CD133， and FGF18.

Results FGF18 was the target gene of miR-21-5p. Compared with the blank group and the negative control （NC） group， the miR-21-5p mimic group had significant reductions in the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of CD133+/CD44+ cells and significant increases in the migration and invasion abilities of CD133+/CD44+ cells， as well as significant increases in the expression levels of CD44， CD133， and FGF18 （F=11.23-886.10，P<0.05）; the miR-21-5p inhibitor group and the si-FGF18 group had significant increases in the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of CD133+/CD44+ cells， significant reductions in the migration and invasion abilities of CD133+/CD44+ cells， and significant reductions in the expression levels of CD44， CD133， and FGF18 （F=10.23-764.70，P<0.05）; there were no significant differences between the si-FGF18+miR-21-5p mimic group and the blank/NC groups （P>0.05）.

Conclusion Downregulating the expression of miR-21-5p and silencing the expression of FGF18 can inhibit the proliferation， migration， and invasion of colon cancer stem cells and promote their apoptosis.

[KEY WORDS]colonic neoplasms; neoplastic stem cells; microRNAs;genes， FGF18; gene silencing; cell proliferation; apoptosis; cell movement

结肠癌是消化道癌症主要表型，其恶性程度较高[1]，病死率位居恶性肿瘤前列，且呈逐年上升趋势，地域和人群差异显著[2]。研究表明，肿瘤干细胞分离和鉴定极大地推动了实体肿瘤如肺癌、消化道癌、生殖系统癌症等的深入研究[3-5]。细胞表面标志物，如CD133、CD44等，已被广泛用于各类恶性肿瘤干细胞的鉴定，如消化道癌等[6]。此外，miRNA是一类可以通过阻断mRNA翻译或者降解目标mRNA，从而发挥基因抑制的内源性非编码的小RNA。miRNA异常表达已被证实与癌细胞增殖、凋亡及转移等关联密切，并参与恶性肿瘤进程，其中miR-21在结肠癌中高表达[7]。本研究基于生物学预测网站发现成纤维细胞生长因子18（FGF18）为促癌基因[8]，是miR-21-5p靶基因之一，然而有关其在结肠癌中的研究尚未见报道。基于此，本研究主要探究了miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌肿瘤干细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

结肠癌HT29细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所提供）;胰蛋白酶（Hyclone公司，USA）;DMEM/F12培养基（Gibco公司，USA）;细胞转染序列（上海奇骏牛物科技有限公司）;分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）;倒置光学显微镜（宁波舜宇光学科技（集团）有限公司）;细胞凋亡检测试剂盒（Sigma公司，USA）;miR-21-5p、FGF18引物合成（Takara，大连宝生物工程有限公司）;荧光定量PCR仪（ABI，USA）;BCA试剂盒（广州威佳生物科技有限公司）;Western blotting试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 CD133+/CD44+结肠癌干细胞分选 将结肠癌HT29细胞进行常规消化，参照既往文献的方法[9]，采用流式细胞分选技术分离筛选CD133+/CD44+结肠癌干细胞。将分选后细胞重悬，在37 ℃、含体积分数0.05 CO 2条件下于6孔板中培养。以供后续细胞增殖、迁移和侵袭及凋亡等实验应用。

1.2.2 CD133+/CD44+细胞培养、分组及质粒转染

观察CD133+/CD44+细胞的生长状况，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO 2条件下继续培养。细胞传代培养过程中，对细胞进行离心和消化处理，吹打成单个细胞。重复上述操作，离心、弃细胞沉淀，吹打混匀成单细胞悬液后，转至6孔板相同条件继续培养备用。选取传代后3～5 d处于对数生长期的状态良好的细胞冻存备用。

取细胞分为如下6组：空白对照组（A组，Blank组）、阴性对照组（B组，NC组）、miR-21-5p模拟物组（C组，miR-21-5p mimic组）、miR-21-5p抑制剂组（D组，miR-21-5p inhibitor组）、FGF18沉默表达组（E组，si-FGF18组）、FGF18沉默表达+ miR-21-5p模拟物组（F组，si-FGF18+miR-21-5p mimic组）。按照不同分组转染质粒，具体转染操作如下。①Blank组：不转染任何序列。②NC组：转染空白质粒。③miR-21-5p mimic组：转染miR-21-5p mimic质粒。④miR-21-5p inhibitor组：转染miR-21-5p inhibitor质粒。⑤si-FGF18组：转染si-FGF18质粒。⑥si-FGF18+miR-21-5p mimic组：转染si-FGF18和 miR-21-5p mimic质粒。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 细胞增殖测定根据细胞计数试剂盒说明书进行操作。取各组转染细胞混悬液加入96孔板中，每组设6个复孔，置于常规细胞培养箱培养。每孔加入CCK8溶液10 μL，继续培养。采用分光光度计测量450 nm波长处吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭能力 取各组转染细胞，消化离心后重悬计数。按常规操作程序分别进行细胞迁移和侵袭实验。细胞迁移实验步骤如下：细胞培养后取Transwell小室，使用40 g/L多聚甲醛固定，5 g/L结晶紫溶液染色并拭去未迁移细胞，光学显微镜下观察并求取平均值。细胞侵襲实验过程中，应用Matrigel稀释液包被Transwell小室底部膜的上室，并在37 ℃条件下将实验样品自然风干，其余操作同细胞迁移实验。比较各组细胞迁移和侵袭能力。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 各组细胞转染48 h后收集细胞于流式管，胰蛋白酶消化液处理细胞，低温离心处理后调节细胞密度。采集细胞悬液，按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，检测细胞凋亡率。

1.2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-21-5p表达及FGF18 mRNA表达 经细胞RNA沉淀、洗涤、溶解和浓度测定后，分别提取各组转染后CD133+/CD44+细胞总RNA。将RNA逆转录成cDNA，参照说明书进行。取反应液进行荧光定量PCR，参照说明书进行操作。采用相对定量法分别计算目的基因miR-21-5p和FGF18相对于内参照（U6）的相对表达量。

1.2.7 Western blotting检测CD133、CD44以及FGF18蛋白表达 待细胞生长至汇合状态（80%），收集细胞加入裂解缓冲液，离心处理后提取各组CD133+/CD44+细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，待样本处理完毕后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜、室温下脱脂奶粉中置于摇床中封闭。滴加一抗兔抗人CD133、CD44和鼠抗人FGF18，4 ℃过夜，PBS洗涤，然后应用HRP标记的羊抗兔IgG抗体孵育（全程避光）。内参照为GAPDH。显影和定影后，采用Image J系统分析计算蛋白相对含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行分析。计量资料数据采用±s形式表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 miR-21-5p与FGF18靶向关系

通过在线分析软件分析显示，FGF18基因与miR-21-5p序列间存在特异结合区域（图1），确定FGF18是miR-21-5p的靶基因。这一靶向关联为本文细胞实验奠定理论基础。

2.2 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞增殖抑制率明显降低（F=16.28，P<0.05），miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组明显升高（F=26.53、23.96，P均<0.05），si-FGF18+miR-21-5p mimic组无明显差异（P>0.05）。而与si-FGF18组相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞增殖抑制率下降，差异有显著性（t=6.181，P<0.05）。见表1。

2.3 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞迁移和侵袭影响

Transwell实验结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞迁移和侵袭能力显著升高;miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组细胞迁移和侵袭能力显著降低，差异具有统计学意义（F 迁移=11.23～19.55，F 侵袭=21.68～52.85，P均<0.05）;si-FGF18+miR-21-5p mimic组细胞迁移和侵袭能力无明显差异（P均>0.05）。而与si-FGF18组细胞相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组细胞迁移和侵袭能力明显上升（t=4.927、8.073，P均<0.05）。见图2。

2.4 miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌干细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞早、晚期凋亡率呈下降趋势;而miR-21-5p inhibitor组和si-FGF18组凋亡率则上升（F 早期=17.22～35.88，F 晚期=24.12～109.80，P均<0.05）;si-FGF18+miR-21-5p mimic组凋亡率差异无显著性（P均>0.05）。

而与si-FGF18组相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组CD133+/CD44+细胞早、晚期凋亡下降（t=10.73、13.47，P均<0.05）。见表1。

2.5 miR-21-5p调控FGF18表达对miR-21-5p和FGF18相对表达影响

qRT-PCR检测结果显示，与Blank组和NC组相比，miR-21-5p mimic组FGF18 mRNA和miR-21-5p的表达水平均显著上升，miR-21-5p inhibitor组FGF18 mRNA和miR-21-5p表达水平均显著下调（F FGF18=29.44、886.10， F miR-21-5p=12.18、764.70，P均<0.05）;si-FGF18组miR-21-5p表达差异无显著性（P>0.05），而FGF18 mRNA表达水平显著下降（F=32.90，P<0.05）;且si-FGF18+miR-21-5p mimic组miR-21-5p表达水平显著上升（F=509.10，P<0.05），而FGF18表达无显著差异（P>0.05）。见表1。

2.6 miR-21-5p调控FGF18表达对CD44、CD133和FGF18蛋白表达影响

Western blotting结果显示，与Blank组和NC组细胞相比较，miR-21-5p mimic组CD44、CD133和FGF18蛋白表达水平均显著上升（F=109.00～551.90，P均<0.05）;miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18组的蛋白表达水平则显著下降（F=9.31～36.45， P均<0.05），si-FGF18+miR-21-5p mimic组的蛋白表达水平无明显变化（P均>0.05）。与si-FGF18组相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic组CD44、CD133和FGF18表达均呈上升趋势（t=3.253～10.18，P均<0.05）。见图3。

3 讨论

本研究首先通过生物学预测软件确定FGF18是miR-21-5p的靶基因。进而采用细胞培养并构建质粒转染方法，探究miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌肿瘤干细胞生物学行为的影响。本研究选用流式细胞分选技术筛选CD133+/CD44+结肠癌干细胞的临床意义在于，上皮来源的恶性肿瘤的发生可能与肿瘤干细胞的增殖、分化等潜能存在关联性[10]。针对肿瘤细胞的恶性特征，既往众多研究已发现肿瘤的进程可归因于肿瘤干细胞的特征，如其可自我更新、增殖分裂等，从而导致肿瘤细胞的耐药性、治疗失败、癌症复发等不良后果。肿瘤治疗多采用外源性干预手段抑制此类干细胞的自我更新，从而阻断细胞增殖、诱导细胞凋亡，最终实现逆转肿瘤细胞增殖分化、转移等[11]。作为肿瘤细胞的标志物，CD133、CD44已被证实在肝癌、骨肉瘤等中呈显著高表达，其表达上调可能与激活下游信号通路、抑制肿瘤细胞凋亡等相关联[12-13]。另外，miR-21-5p已被报道与人类消化道癌症等密切相关[14-15]，并通过作用众多的基因靶点参与肿瘤进展，为肿瘤靶向治疗提供新途径。WU等[16]研究显示，miR-21-5p高表达可通过抑制PTEN、激活P13K/Akt信号通路、诱导上皮间质转化等机制促进食管癌发生进程。因此，作者推测miR-21-5p有可能通过特定靶基因，干预结肠癌干细胞生物学进程。FGF18作为成纤维细胞因子，属于纤维细胞因子（FGF）家族，是典型的促癌基因。FGF家族成员在血管生成、组织细胞增殖、成纤维细胞增生等方面发挥重要作用，通过翻译转录可发挥多种潜在功能[17]。FGF18在癌症中呈高表达，如在卵巢高级浆膜癌中呈显著高表达，促进癌症进展[18]。

本研究结果表明，下调miR-21-5p表达和沉默FGF18表达后CD133+/CD44+细胞增殖抑制率和凋亡率显著提升，而迁移和侵袭能力显著降低;而上调miR-21-5p表达结果与此相反;且在上调miR-21-5p表達基础上沉默FGF18表达，逆转了沉默FGF18表达对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的作用。本文结果提示，miR-21-5p低表达可在结肠癌干细胞增殖、迁移和转移中发挥正向作用;同时，下调miR-21-5p表达可抑制FGF18表达，进一步凸显了对结肠癌干细胞生物学行为的调控作用。此外，上调miR-21-5p表达后导致FGF18、CD133、CD44蛋白表达水平显著上升;而下调miR-21-5p表达，靶向抑制FGF18，上述因子的表达水平均显著逆转。就其机制而言，微小RNA通常通过靶基因调节转录后表达。我们推测其可能与FGF18为miR-21-5p靶基因，miR-21-5p通过与其3′端非翻译区特异性结合，抑制作为促癌基因FGF18的表达水平，从而达到抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的结果。LU等[19]报道，过表达miR-21-5p可靶向15-PGDH，促进胆管癌生长。YAN等[20]亦在其研究中通过基因组微阵列数据和靶向预测miR-21-5p可靶向PIK3R1，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，降低PI3K/AKT信号转导并逆转上皮间质转化，在乳癌中发挥重要作用。本研究亦通过类似机制性探讨，初步显示miR-21-5p与其靶基因FGF18在结肠癌肿瘤干细胞中的作用，为临床探究结肠癌治疗提供了一定的实验依据。

综上所述，本研究证实抑制miR-21-5p表达并沉默FGF18表达，可抑制结肠癌肿瘤干细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。本实验为靶向miR-21-5p和FGF18的分子治疗策略提供了实验基础。同时，本研究有待进一步的动物移植瘤实验验证，并佐以进一步的实验探究抑制miR-21-5p表达对肿瘤细胞药物敏感性以及临床病人预后方面的影响。

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（本文编辑 于国艺）