α7-nAChR正向变构调节剂对原代海马神经元活性影响

王梦真

[摘要] 目的 探讨α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7-nAChR）的正向变构调节剂（PAM）NS1738（Ⅰ型PAM）和PNU120596（Ⅱ型PAM）对原代培养的海马神经元活性的影响。

方法 原代培养的海马神经元用胆碱（choline）、choline+NS1738、choline+PNU120596处理7 d后，采用蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测LDH的分泌情况，流式细胞仪检测线粒体膜电位（△Ψm）的变化。

结果

与对照组（不做任何处理）相比，choline+NS1738组和choline+PNU120596组原代海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达比值显著降低（F=12.15，q=7.742、6.982，P<0.05），LDH分泌明显减少（F=11.72，q=6.551、7.807，P<0.05），△Ψm明显升高（F=21.73，q=7.835、4.331，P<0.05）。与choline组相比较，choline+NS1738组和choline+PNU120596组原代海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达比值和LDH分泌差异无显著性（P>0.05）;而△Ψm明显升高，差异具有统计学意义（F=21.73，q=10.550、7.045，P<0.05）。

结论 α7-nAChR PAM能够减少原代培养海马神经元的凋亡数量，升高细胞活性。

[关键词] α7烟碱型乙酰胆碱受体;神经递质药;海马;神经元;细胞活性;膜电位，线粒体

[中图分类号] R338.2;R971

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0811-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.201

[開放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1017.006.html;2021-12-30 14：40：09

EFFECT OF α7-NACHR POSITIVE ALLOSTERIC MODULATOR ON PRIMARY HIPPOCAMPAL NEURON ACTIVITY

WANG Mengzhen

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medical， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To explore the effects of alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor （α7-nAChR） positive allosteric modulator （PAM） NS1738 （type Ⅰ PAM） and PNU120596 （type Ⅱ PAM） on the activity of primary cultured hippocampal neurons.

Methods The primary cultured hippocampal neurons were separately treated with choline， choline + NS1738， and choline + PNU120596 for 7 days. Western blot was used to measure the expression of Bax and Bcl-2 proteins， and lactate dehydroge-

nase （LDH） kits were used to measure the LDH release; flow cytometry was used to measure the change in mitochondrial membrane potential （△Ψm）.

Results Compared with the control group （without any treatment）， the choline + NS1738 group and choline + PNU120596 group had significantly reduced Bax/Bcl-2 protein expression ratios （F=12.15;q=7.742，6.982;P<0.05） and LDH secretion （F=11.72;q=6.551，7.807;P<0.05）， and significantly increased △Ψm （F=21.73;q=7.835，4.331;P<0.05） in primary hippocampal neurons. There were no significant differences in the Bax/Bcl-2 protein expression ratio and LDH secretion in primary hippocampal neurons between the choline group and the choline+NS1738 group or choline+PNU120596 group （all P>0.05）， but compared with the choline group， the choline + NS1738 group and choline + PNU120596 group had significantly increased △Ψm （F=21.73;q=10.550，7.045;P<0.05）.

Conclusion α7-nAChR PAM can reduce the apoptosis of primary cultured hippocampal neurons and increase cell viability.

[KEY WORDS]alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor; neurotransmitter agents; hippocampus; neurons; cell viability; membrane potential， mitochondrial

阿尔兹海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其记忆障碍与神经元变性以及突触损伤有关[1-2]。神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）是公认的认知和神经退行性疾病中药物开发的靶标[3]。在中枢神经系统中，nAChR以同聚或异聚形式存在，其中含量最丰富的同聚nAChR是α7-nAChR，α7-nAChR是大脑（尤其是海马）中主要的nAChR亚型之一[4-5]。

α7-nAChR属于五聚体配体门控离子通道超家族，它通过打开可渗透阳离子的内在通道对乙酰胆碱（Ach）做出应答，从而触发膜快速除极和钙离子内流[2]。有研究表明，α7-nAChR与AD的发病机制有关[6]，并且β-淀粉样蛋白（Aβ）对α7-nAChR有极高亲和力，且影响α7-nAChR的功能[7-10]。在AD病人和动物模型中，α7-nAChR的表达水平明显升高[11-13]。另有研究结果表明，nAChR的α7亚基基因缺失可改善AD模型小鼠的功能缺陷[14]，这提示α7-nAChR表达上调可能参与了AD的发病[15]。众所周知，α7-nAChR具有较高的Ca2+渗透性[16]，并且α7-nAChR的激活可以增加突触前谷氨酸的释放[17]，这两者都可能会导致神经毒性。本实验的主要目的是探讨在低浓度胆碱（choline）存在的条件下，α7-nAChR正向变构调节剂（PAM）NS1738（Ⅰ型PAM）和PNU120596（Ⅱ型PAM）对海马神经元活性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

DMEM高糖及DMEM/F12培养液（美国Hyclone公司），青霉素/链霉素双抗溶液（中国索莱宝科技有限公司），2.5 g/L胰蛋白酶（以色列BI公司），B27无血清添加剂（美国Gibco公司），D-多聚赖氨酸（美国Sigma公司），Choline、PNU120596及NS1738（中国MCE公司），Bax抗体（中国Cell Signaling Technology公司），Bcl-2抗体（中国Absin公司），乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）;37 ℃恒温培养箱，酶标仪，流式细胞仪。

1.2 原代海马神经元培养

实验前高压处理实验所用器械，烘干箱烘干;细胞培养板用D-多聚赖氨酸提前3 h铺板，用高压灭菌双蒸水清洗3次备用。将新生24 h以内SD乳鼠断头取脑，置DMEM高糖基础培养液中，取出海马组织，去除脑膜和血管膜，37 ℃下用胰蛋白酶消化5 min，加入终止液终止消化。用不同量程的枪头轻轻梯度吹打，将组织吹打成单细胞悬液，每吹打完1次取上清于离心管中，吹打结束后以1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含有体积分数0.02 B27无血清添加剂、体积分数0.01青霉素/链霉素双抗的DMEM/F12基础培养液配制的培养液重悬，以2×108/L的细胞密度接种于12孔板中，每3.5 d换液1次，培养细胞至7 d左右，观察细胞状态以进行后续实验。实验全程在冰上操作。

1.3 实验分组及处理

将海马神经元细胞分为对照组（A组，不进行任何处理）、choline组（B组）、choline+NS1738组（C组）和choline+PNU120596组（D組）。Choline、NS1738和PNU120596的药物处理浓度分别为1、5、1 μmol/L。将细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO 2的培养箱中培养，每24 h重新更换培养液并加药处理，共处理7 d。

1.4 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测Bax、Bcl-2蛋白表达

在12孔板中加入50 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，用细胞刮板将培养板底的细胞刮下，用移液器将裂解液转移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min离心30 min。用移液器吸取40 μL上清至另一EP管中，使用BCA试剂盒检测上清液中蛋白质浓度，加入5×Loading Buffer，95 ℃以上加热5 min。按照BCA试剂盒检测的蛋白浓度计算SDS-PAGE凝胶电泳的上样量，电泳电压80 V，跑进分离胶后，将电压调至120 V。电泳之后将蛋白转至PVDF膜上，300 mA湿转90 min，切下所需分子量的条带，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，分别加入用TBST稀释的Bax抗体（1∶1 000）、Bcl-2抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶10 000）孵育相应的条带，4 ℃摇床过夜。以TBST洗条带3次，每次10 min，加入HRP偶联的山羊抗兔二抗（稀释比例1∶10 000）室温孵育1 h，孵育完成后以TBST洗3次，每次10 min。用ECL发光液避光孵育1 min显影。应用Image J软件对条带进行分析，以目的条带与内参照条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对含量。

1.5 海马神经元LDH分泌量检测

细胞处理结束后，各组取部分培养液，置于冰上以备LDH检测。LDH检测严格按照试剂盒说明书进行。将待测样本转移到96孔板中，加入基质缓冲液和辅酶Ⅰ，37 ℃孵育15 min，加入2，4-二硝基苯肼，37 ℃孵育15 min，加入NaOH溶液，室温孵育5 min，用酶标仪测定各孔在波长450 nm处的吸光度值。按照试剂盒说明书的公式计算培养液中LDH含量。

1.6 线粒体膜电位（△Ψm）检测

细胞处理结束后弃上清液，用0.01 mol/L的HBS清洗1次，每孔加入5 mg/L的罗丹明123（Rh123）溶液500 μL，37 ℃避光孵育30 min，吸除Rh123，使用HBS清洗3次，每孔加入新的HBS 500 μL，吹打成单细胞悬液，用300目细胞筛过滤到流式管中，以激发波长488 nm、发射波长523 nm进行测定，FCS/SSC设门，收集门内10 000个细胞，用CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞的荧光强度。

1.7 统计学处理

使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理。实验结果以±s形式表示，多组比较采用单因素方差分析，并继以Tukey法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NS1738和PNU120596对原代海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比，choline组、choline+NS1738组、choline+PNU120596组Bax/Bcl-2蛋白表达比值均明显下降，差异均具有统计学意义（F=12.15，q=4.742～7.742，P<0.05）;与choline组相比较，choline+NS1738组、choline+PNU120596组Bax/Bcl-2蛋白表达比值差异无显著意义（q=3.000、2.240，P>0.05）。见表1。

2.2 NS1738和PNU120596对原代海马神经元LDH分泌的影响

与对照组相比，choline组、choline+NS1738组、choline+PNU120596组LDH分泌明显减少，差异具有统计学意义（F=11.72，q=4.975～7.807，P<0.05）;与choline组相比，choline+NS1738组、choline+PNU120596组LDH分泌差异无显著性（q=1.576、2.832，P>0.05）。见表1。

2.3 NS1738和PNU120596对原代海马神经元△Ψm的影响

与对照组相比，choline+NS1738组、choline+PNU120596组△Ψm明显升高，差异具有统计学意义（F=21.73，q=7.835、4.331，P<0.05）;与choline组细胞相相比，choline+NS1738组、choline+PNU120596组△Ψm也明显升高，差异具有统计学意义（q=10.550、7.045，P<0.05）;choline组△Ψm与对照组相比差异无显著性（q=2.714，P>0.05）。见表1。

3 讨论

AD的一个标志是Aβ沉积，这被认为是淀粉样蛋白前体蛋白（APP）加工异常和Aβ产生增加的结果[18]。α7-nAChR属于五聚体配体门控离子通道超家族，它通过打开可渗透阳离子的内在通道对Ach做出应答，从而触发膜快速除极和钙离子内流[2]。有证据表明，α7-nAChR与AD相关，参与认知、学习记忆、奖赏等过程[19]，在AD病人大脑（尤其是海马）中α7-nAChR表达明显减少[20]，并且表达α7-nAChR的神经元更容易出现AD神经病理学特征[21]。受体激动剂的应用可能引起受体活化，但也会使其脱敏，可能无助于甚至是阻碍了受体对生理神经元活性的反应[22]。α7-nAChR的PAM是一类化合物，分为两种类型：Ⅰ型（例如NS1738）主要增强激动剂诱发的峰值电流，但可保持其快速动力学特征，并且不会重新激活脱敏受体;Ⅱ型（例如PNU120596）可以延迟脱敏受体，并可重新激活脱敏受体[22]。PAM需要内源性配体（即Ach或choline）来引发nAChR反应[19]。PAM通过结合激动剂或抑制剂的正构位点来调节受体的功能，进而促进细胞内信息传递。PAM的存在可以维持生理活动时空模式，并增强響应，所以与激动剂相比，PAM具有内源性激活特性，对受体更具选择性，因此是更有前途的治疗策略[23]。

但是，目前还不清楚α7-nAChR的下调或上调是否与AD的发病机制有关[5]。本实验结果显示，与对照组相比较，choline组Bax/Bcl-2蛋白表达比值下降，在存在1 μmol/L choline的条件下，应用α7-nAChR PAM NS1738和PNU120596后，海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达比值也明显下降。Bax和Bcl-2属于细胞死亡的调节蛋白，在正常生理条件下，Bax家族可促进凋亡发生，而Bcl-2家族抑制凋亡发生，所以当细胞发生凋亡时，Bax/Bcl-2比值上升。该比值变小表明，使用α7-nAChR的PAM处理时，海马神经元凋亡数量减少。当细胞凋亡时，细胞膜会发生破裂，细胞内的LDH释放到细胞外，导致培养液中的LDH含量增加。本文研究结果显示，choline组、choline+NS1738组和choline+PNU120596组的LDH分泌减少，也印证了海马神经元凋亡数量减少。当细胞出现凋亡时，△Ψm减小甚至消失。而本文结果显示，choline+NS1738组和choline+PNU120596组的△Ψm升高。上述实验结果在一定程度上表明，在choline浓度较低的条件下，应用两种PAM并未导致细胞凋亡的出现，也从侧面反映出了两种药物可提高海马神经元活性。但是与choline组相比，PAM处理组的Bax/Bcl-2蛋白表达比值和LDH释放差异均无显著性，而△Ψm明显升高。这表明在choline浓度较低的情况下，两种PAM只引起了能量代谢方面的变化，细胞外的蛋白水平还未出现明显变化，后续或许应该提高choline和PAM的浓度进一步研究。

[参考文献]

[1]SELKOE D J， HARDY J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years[J].EMBO Molecular Medicine， 2016，8（6）：595-608.

[2]LASALA M， FABIANI C， CORRADI J， et al. Molecular modulation of human α7 nicotinic receptor by amyloid-β peptides[J].Frontiers in Cellular Neuroscience， 2019，13：37.

[3]WILLIAMS D K， WANG J Y， PAPKE R L. Positive alloste-

ric modulators as an approach to nicotinic acetylcholine receptor-targeted therapeutics： advantages and limitations[J].Biochemical Pharmacology， 2011，82（8）：915-930.

[4]WHITING P J， LINDSTROM J M. Characterization of bovine and human neuronal nicotinic acetylcholine receptors using monoclonal antibodies[J].The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 1988，8（9）：3395-3404.

[5]BORRONI V， KAMERBEEK C， PEDICONI M F， et al. Lo-

vastatin differentially regulates α7 and α4 neuronal nicotinic acetylcholine receptor levels in rat hippocampal neurons[J].Molecules （Basel， Switzerland）， 2020，25（20）：E4838.

[6]LIU Q， XIE X， LUKAS R J， et al. A novel nicotinic mechanism underlies beta-amyloid-induced neuronal hyperexcitation[J].Journal of Neuroscience， 2013，33（17）：7253-7263.

[7]WANG H Y， LEE D H， D’ANDREA M R， et al. Beta-Amyloid（1-42） binds to alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor with high affinity. Implications for Alzheimer’s disease pathology[J].The Journal of Biological Chemistry， 2000，275（8）：5626-5632.

[8]WANG H Y， LEE D H， DAVIS C B， et al. Amyloid peptide Abeta（1-42） binds selectively and with picomolar affinity to alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors[J].Journal of Neurochemistry， 2000，75（3）：1155-1161.

[9]LIU Q， KAWAI H， BERG D K. Beta-Amyloid peptide blocks the response of alpha 7-containing nicotinic receptors on hip-

pocampal neurons[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2001，98（8）：4734-4739.

[10]PETTIT D L， SHAO Z， YAKEL J L. Beta-Amyloid（1-42） peptide directly modulates nicotinic receptors in the rat hip-

pocampal slice[J].The Journal of Neuroscience， 2001，21（1）：RC120.

[11]JONES I W， WESTMACOTT A， CHAN E， et al. Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor expression in Alzheimer’s di-

sease： receptor densities in brain regions of the APP （SWE） mouse model and in human peripheral blood lymphocytes[J].Journal of Molecular Neuroscience： MN， 2006，30（1/2）：83-84.

[12]COUNTS S E， HE B， CHE S L， et al. Alpha 7 nicotinic receptor up-regulation in cholinergic basal forebrain neurons in Alzheimer disease[J].Archives of Neurology， 2007，64（12）：1771-1776.

[13]IKONOMOVIC M D， WECKER L， ABRAHAMSON E E， et al. Cortical alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor and beta-amyloid levels in early Alzheimer disease[J].Archives of Neurology， 2009，66（5）：646-651.

[14]DZIEWCZAPOLSKI G， GLOGOWSKI C M， MASLIAH E， et al. Deletion of the alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor gene improves cognitive deficits and synaptic pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease[J].The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2009，29（27）：8805-8815.

[15]LIU Q， XIE X T， EMADI S， et al. A novel nicotinic mechanism underlies β-amyloid-induced neurotoxicity[J].Neuropharmacology， 2015，97：457-463.

[16]BERTRAND D， BERTRAND S， BALLIVET M. Pharmacological properties of the homomeric alpha 7 receptor[J].Neuroscience Letters， 1992，146（1）：87-90.

[17]MCKAY B E， PLACZEK A N， DANI J A. Regulation of synaptic transmission and plasticity by neuronal nicotinic acetylcholine receptors[J].Biochemical Pharmacology， 2007，74（8）：1120-1133.

[18]GOEDERT M， SPILLANTINI M G. A century of Alzheimer’s disease[J].Science， 2006，314（5800）：777-781.

[19]TERRY A V， CALLAHAN P M. Nicotinic acetylcholine receptor ligands， cognitive function， and preclinical approaches to drug discovery[J].Nicotine & Tobacco Research， 2019，21（3）：383-394.

[20]DINELEY K T， PANDYA A A， YAKEL J L. Nicotinic ACh receptors as therapeutic targets in CNS disorders[J].Trends in Pharmacological Sciences， 2015，36（2）：96-108.

[21]MA K G， QIAN Y H. Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor and its effects on Alzheimer’s disease[J].Neuropeptides， 2019，73：96-106.

[22]PESTI K， LUKACS P， MIKE A. Type Ⅰ-like behavior of the type Ⅱ α7 nicotinic acetylcholine receptor positive allosteric modulator A-867744[J].Peer J， 2019，7：e7542. doi：10.7717/peerj.7542.

[23]BOUZAT C， LASALA M， NIELSEN B E， et al. Molecular function of α7 nicotinic receptors as drug targets[J].The Journal of Physiology， 2018，596（10）：1847-1861.

（本文編辑 马伟平）