貉流产死胎分离出致病大肠杆菌

刘勃兴 赵安奇 刘 畅 王利丽 张雪佳吴同垒 高桂生 史秋梅 张志强

(河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛，066004)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是畜禽生产中的常见致病菌，不同类型的大肠杆菌所致发病症状存在差异。肠外致病性大肠杆菌可引起动物急性败血症、呼吸道炎症以及泌尿道炎症等[1]。毛皮动物也可感染大肠杆菌，主要表现为腹泻、肺炎，严重可致败血症死亡。尤其是大肠杆菌性肺炎，近年来在毛皮动物养殖中十分常见，是造成毛皮动物死亡的最主要病原之一[2]。大肠杆菌感染还可引起怀孕母畜流产[3]。前期报道从多种动物流产胎儿分离出致病性大肠杆菌，揭示其可能是重要的致流产病原[4-7]。大肠杆菌感染引起毛皮动物流产鲜见报道，2015、2018年的2例报道首次从流产蓝狐(Vulpeslagopus)和水貂(Mustelavison)胎儿体内分离大肠杆菌，怀疑其可能在毛皮动物上引发流产的致病原[4-5]。

春季是毛皮动物繁殖季节，也是流产的高发季节。在毛皮动物上能够引起流产的病原主要有阿留申病毒、伪狂犬病毒、犬瘟热病毒等病毒性病原以及加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、布氏杆菌(Brucella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等细菌性病原。除此之外，附红细胞体(Eperythrozoon)、旋毛虫(Trichinellaspiralis)、蛔虫(Ascarislumbricoides)等寄生虫也可能引起流产[8-9]。多种病原均可导致毛皮动物流产，使临床诊断流产原因难度增加，因此，大肠杆菌往往被忽略。

2019年5月接诊到一起貉(Nyctereutesprocyonoides)流产病例，对其致病原进行检测，结果未检测到可致母貉出现流产症状的病毒、寄生虫等病原。对流产胎儿肝脏、脾脏、心脏等脏器细菌进行分离鉴定，分离到1株能在血琼脂平板上出现β溶血环的大肠杆菌，将分离菌株接种小鼠，证实其具有较强致病性，感染怀孕母鼠可致流产。进一步分析发现其致病和耐药情况复杂。

1 材料与方法

1.1 材料

貉流产胎儿来自秦皇岛市某发病貉养殖场送样，无菌采取肝脏、脾脏、心脏等脏器。

1.2 主要试剂与仪器

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯琼脂培养基，均购自北京陆桥科技股份有限公司；哥伦比亚血琼脂培养基(羊血)，购自广州迪景微生物科技有限公司；革兰氏染色液，购自北京博奥拓达科技有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物科技股份有限公司；ID32E肠道菌鉴定试条，购自法国梅里埃公司；D2000 plus DNA marker，购自中科瑞泰科技有限公司；E.coliO型诊断血清，购自天津生物芯片技术有限责任公司；2×TaqMaster Mix，细菌DNA基因组提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司。PCR仪器、琼脂糖凝胶电泳成像仪、立式自动压力蒸气灭菌器、无菌工作台、隔水式恒温培养箱等，由河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点试验室提供。PCR扩增引物合成和序列测定服务均由上海生工生物公司完成。

1.3 试验动物

维通利华试验动物有限公司。

1.4 病原菌的分离鉴定

1.4.1 病原菌的分离、鉴别培养与革兰氏染色

用灭菌后棉签无菌蘸取肝脏、心脏、脾脏等脏器样品，接种于血琼脂平板上，37℃恒温培养12 h，挑取单个菌落接种于营养肉汤，37℃ 200 r/min恒温摇床培养12 h。将分离菌分别在伊红美蓝培养基、麦康凯琼脂培养基上分区划线，37℃恒温培养12 h后观察菌落状态。对分离菌进行革兰氏染色，镜检。

1.4.2 生化特性鉴定

参考李文艳[10]的方法，用ID32E肠道菌鉴定试条对分离菌进行生化鉴定，并用ATB自动生化鉴定系统对结果进行判定。

1.4.3 分离菌的16S rDNA鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，并以其为模板，参考张志强等[11]的16S rDNA通用引物进行PCR，引物序列：16Sr-F(5′CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3′)；16Sr-R(5′-CAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3′)。将PCR产物送上海生工生物公司测序，将测序结果拼接，用NCBI BLAST分析比对。

1.4.4 大肠杆菌血清型检测

采用单因子血清玻片凝集法测定大肠杆菌的血清型，具体操作参照试剂说明书。

1.5 致病性试验

试验前参考文献[10]处理母鼠使其怀孕。选取8周龄小鼠，公母各1只合笼。次日，观察母鼠是否有阴门栓形成，若有，则判定为妊娠，继续饲养6 d后挑选5只怀孕母鼠进行试验。

参考李巧玲等[4]及张志强等[11]的攻毒剂量，进行致病性试验。未怀孕组小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液(菌液浓度为1.0×108cfu/mL)，怀孕组母鼠5只，每只母鼠腹腔注射0.2 mL菌液(菌液浓度为1.0×104cfu/mL)。对照组未怀孕小鼠和怀孕母鼠各5只，每只小鼠腹腔注射0.2 mL无菌PBS。观察并记录每组小鼠状态。

1.6 毒力基因检测

以提取分离菌DNA为模板，用PCR方法检测分离菌毒力基因携带情况。大肠杆菌毒力基因参考文献[12](表1)，PCR反应程序退火温度 58℃。

表1 毒力基因引物Tab.1 Virulence gene primers

续表1

1.7 药物敏感性试验

按照美国临床和试验室标准协会(CLSI)的标准，采用K-B药敏纸片法对分离菌进行药物敏感性试验。试验重复3次，取抑菌圈直径平均值为最终结果。

1.8 耐药基因检测

参照1.4.3中的方法提取细菌基因组，用 PCR方法检测分离菌耐药基因。大肠杆菌耐药基因引物(表2)及PCR反应程序参照文献[13]。

表2 耐药基因引物Tab.2 Drug resistance gene primers

续表2

2 结果与分析

2.1 细菌的分离鉴定

2.1.1 分离菌菌落形态与革兰氏染色

分离菌在血琼脂平板上培养，菌落有明显β溶血环。在伊红美蓝培养基上培养，分离菌菌落呈紫黑色，有金属光泽。在麦康凯琼脂上培养，分离菌菌落呈红色。对分离菌进行革兰氏染色，镜检。镜检结果为革兰氏染色阴性杆菌，两端钝圆。根据细菌菌落形态与革兰氏染色镜检结果初步判定为大肠杆菌。

2.1.2 生化特性鉴定

用ID32E肠道菌鉴定试条对分离菌进行生化鉴定，并用ATB自动生化鉴定系统对结果进行判定，生化鉴定结果显示：d-葡萄糖、赖氨酸脱羧酶、L-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、d-半乳糖酸盐同化、d-海藻糖、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、d-麦芽糖、蔗糖、酚红检测结果为阳性，经ATB自动生化鉴定仪分析结果为大肠杆菌。

表3 LCE-1菌株生化鉴定结果Tab.3 Biochemical identification results of LCE-1 strain

2.1.3 分离菌16S rDNA鉴定

将分离菌用16S rDNA通用引物进行PCR检测，将PCR产物送上海生工生物公司测序，将测序结果用NCBI BLAST进行序列比对，分离菌与大肠杆菌属同源性最高。

从GenBank上下载大肠杆菌属参考菌株以及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的克雷伯菌属(Klebsiella)、沙门菌属(Salmonella)，以及巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)的巴氏杆菌属(Pasteurella)参考菌株的16 S rDNA序列，用Lasergene软件的Megalign功能进行序列分析和系统发育树构建，发现分离菌与其他大肠杆菌属参考菌株处于同一分支，与肠杆菌科的沙门参考菌株、克雷伯参考菌株属于同一个大分支，而与巴氏杆菌科成员亲近性相对较远。

2.1.4 大肠杆菌血清型检测

通过玻片凝集试验检测分离菌，结果显示分离菌为O89血清型大肠杆菌。结合鉴定培养基培养、革兰氏染色、生化鉴定、16S rDNA基因测序分析的试验结果，判定分离菌为大肠杆菌，命名为LCE-1。

2.2 致病性试验

将LCE-1菌以每只0.2 mL菌液(菌液浓度为1.0×108cfu/mL)的剂量感染未怀孕小鼠，24 h后LCE-1组小鼠全部死亡，对照组小鼠无死亡。对照组小鼠连续观察2周，小鼠均无死亡，精神状态良好，无任何病征。

将LCE-1菌以每只0.2 mL菌液(菌液浓度为1.0×104cfu/mL)感染怀孕母鼠，24 h后LCE-1组怀孕母鼠出现流产病征，精神萎靡。72 h后5只LCE-1组母鼠全部流产，并有1只母鼠死亡。对照组怀孕小鼠无变化。10 d后，对照组小鼠陆续正常分娩。

将死亡小鼠肝脏、脾脏、心脏，流产母鼠子宫细菌分离鉴定，同样分离到大肠杆菌。

2.3 毒力基因检测

采用用PCR对LCE-1菌的毒力基因进行检测。结果显示：vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA6种毒力基因检测阳性。试验数据表明LCE-1携带多种毒力基因，其致病性可能与这6种毒力基因有关。

2.4 药物敏感性试验

采用K-B纸片法对LCE-1菌株进行药物敏感性试验，试验结果判定参照CLSI标准。试验结果显示：LCE-1对麦迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林、克林霉素、万古霉素、红霉素、米诺环素、多粘菌素B、丁胺卡那、复方新诺明、多西环素、氯霉素、卡那霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、青霉素、四环素共19种药物耐药；对哌拉西林、头孢唑林、头孢哌酮、羧苄西林、头孢曲松、新霉素6种药表现中敏；对环丙沙星、头孢他啶、氧氟沙星、庆大霉素、诺氟沙星5种药物表现敏感(表4)。其中，万古霉素、氧氟沙星、诺氟沙星为农业部公告的禁用兽药，只用于试验研究。分离菌的药物敏感性试验数据显示，LCE-1菌多重耐药性十分严重。

表4 药敏试验结果Tab.4 Drug sensitivity test results

2.5 耐药基因检测

用PCR对LCE-1菌的耐药基因进行检测。试验结果显示：四环素类(tetA、tetC、tetD)、β-内酰胺类药(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷类(aadA1、strA-strB)、磺胺类(sul1、sul2)耐药基因检测阳性。试验数据显示，LCE-1携带多种耐药基因，进一步解释了为何LCE-1多重耐药情况如此严重。

3 讨论

大肠杆菌为一种在自然条件下普遍存在的条件性致病菌，可感染多种家畜、家禽以及人类发病。动物感染大肠杆菌后常出现腹泻、败血症、免疫力降低等症状。本研究在秦皇岛某貉养殖场怀孕母貉流产病因进行诊断，对送检流产胎儿进行病毒(阿留申病毒、伪狂犬病毒、犬瘟热病毒)、寄生虫(附红细胞体、旋毛虫、蛔虫)、细菌(加德纳氏菌、布氏杆菌、铜绿假单胞菌)检测，结果均为阴性。但在肝脏、脾脏、心脏等脏器分离出1株优势菌株，该菌株菌落在血琼脂平板有明显β溶血环。通过伊红美蓝、麦康凯鉴定培养基培养观察菌落形，革兰氏染色镜检观察细菌形态初步判定为大肠杆菌。进一步进行细菌生化鉴定，16S rDNA 序列分析，大肠杆菌血清型检测，最终结果判定为大肠杆菌，血清型为O89型，并命名为LCE-1。

本研究进一步对LCE-1的致病性进行研究。本研究将LCE-1以不同剂量分别感染未怀孕小鼠以及怀孕母鼠，发现该菌能导致未怀孕小鼠死亡，怀孕母鼠流产。剖检死亡小鼠，发现其内脏器官出现严重的出血，并从死亡小鼠肝脏、脾脏和心脏，流产母鼠子宫内同样分离到大肠杆菌。表明LCE-1是致小鼠死亡以及怀孕母鼠流产的病原。但LCE-1是否可致母貉流产还需进一步研究。前有报道从流产蓝狐、水貂胎儿中分离到致病大肠杆菌，2004年赵传芳等[14]从流产貉的子宫内膜分离到致病大肠杆菌，本研究从貉流产胎儿脏器分离出具有较强致病性大肠杆菌，表明在临床诊断貉流产病时，大肠杆菌是不可忽略的重要病原。

大肠杆菌的致病性主要与其携带的毒力基因有关[15]，为了研究其致病原因，本研究初步对LCE-1大肠杆菌的毒力基因进行检测，发现其携带有vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA毒力基因。Vat为空泡形成毒素基因，可导致宿主细胞空泡化；ECs3737为ETT2毒力岛标志基因；iucD为气杆菌素编码基因，iroN为铁结合性复合物内化的受体，irp2和fyuA为强毒力岛(HPI)的编码基因，这4个大肠毒力基因都可以影响机体铁摄取，这可能是致病的主要因素。而大肠杆菌发挥致病作用为一个复杂的过程，空泡形成毒素基因Vat、ETT2毒力岛基因与摄铁系统的毒力基因的共同存在可能才是最终导致母畜流产的原因。但目前大肠杆菌致母畜流产的致病机制以及流产症状与毒力基因之间的关系尚不明确。

在不同的时间，不同的地区流行的大肠杆菌的血清型不同，其致病力也存在差异[16]。通过对LCE-1血清型鉴定，鉴定其为O89型大肠杆菌。O89型大肠杆菌为我国禽类致病大肠杆菌的流行型，在貉中分离出该血清型大肠杆菌可能为在饲料中添加有禽类产品或将人食用后的剩菜剩饭等饲喂貉所致，从而引起貉发病。

在临床治疗大肠杆菌病时，有时抗生素类药物不能有效地控制住病情，但当前大肠杆菌病的防治还是以抗生素类药物为主[17]。为了指导临床用药，本研究挑选30种临床常见的药物，发现LCE-1菌株对麦迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林等19种药物耐药，对哌拉西林、头孢唑林、头孢哌酮、羧苄西林、头孢曲松、新霉素6种药中敏，对环丙沙星、头孢他啶、氧氟沙星、庆大霉素、诺氟沙星5种药敏感。本研究选取的30种药物种，包括了兽医临床常用抗生素、农业部禁用抗生素以及人医常用抗生素等，发现该大肠杆菌对19/30的药物耐药。胎儿在母体内并不能直接与药物接触，而从流产胎儿脏器中分离出的LCE-1菌株表现为多重耐药，由此猜测LCE-1来自于母貉，并且通过胎盘垂直传播给胎儿，但具体原因应进一步研究。细菌多重耐药性的产生不仅给动物疾病的防治带来了困难，而且还给食品安全以及人类健康也造成严重的威胁，应引起大家的重视[18]。

大肠杆菌的耐药性主要是耐药质粒通过接合、转化、转导等方式在不同菌株之间传递，使敏感菌成为耐药菌[19]，而多种耐药基因的存在是导致大肠杆菌多重耐药性的主要原因。通过对LCE-1菌的四环素类等5种类药物耐药基因进行检测发现，该菌携带有四环素类(tetA、tetC、tetD)、β-内酰胺类(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷类(aadA1、strA-strB)、磺胺类(sul1、sul2)药物的耐药基因。进一步证实了大肠杆菌多重耐药性的产生与耐药基因的存在有着一定的关系。

毛皮动物养殖是秦皇岛市的支柱产业，母畜流产可给养殖户造成严重的经济损失。在临床诊断貉流产病例中，普遍认为大肠杆菌并非是导致流产的主要病原，因此缺乏对大肠杆菌的关注。本研究在貉流产死胎脏器分离出致病大肠杆菌，该株菌对小鼠具有较强致病性，可致怀孕小鼠流产，并具有严重的多重耐药性。本研究揭示大肠杆菌可能为貉流产的病原，为该病的防控奠定基础。