三株美洲驼源狂犬病病毒N基因遗传进化分析

王金玲 郑秉武 曹 霞 杨龙峰 葛金英 卢爱桃

(1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特，010010；2.农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特，010010；3.呼和浩特市园林管理局动物园管理处，呼和浩特，010050；4.北京市延庆区动物疫病预防控制中心，北京，102100；5.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨，150001；6.内蒙古自治区综合疾病预防控制中心，呼和浩特，010031)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的一种以致死性脑炎为特征的人畜共患传染病[1-3]。RABV宿主范围广，可感染人(Homosapiens)、鼠(Rattus)、家兔(Oryctolaguscuniculusdomesticus)、豚鼠(Caviaporcellus)、马(Equuscaballus)、牛(Bos)、羊(Caprinae)、犬(Canis)、猫(Felidae)等所有温血动物，其死亡率接近100%[4]。RABV为弹状病毒科(Rhaboviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)成员，其基因组为不分节段的单股负链RNA[5]。目前，世界卫生组织已将RABV分为7种基因型，基因Ⅰ型、基因Ⅱ型(Lagos蝙蝠株)、基因Ⅲ型(Mokola病毒原型株)、基因Ⅳ型(Duvenhage原型株)、基因Ⅴ型(EBLV1)、基因Ⅵ型(EBLV2)[1]和基因Ⅶ型(ABLV)[6]。目前，中国RABV分离株来源于6个进化分支，ChinaⅠ、ChinaⅡ、ChinaⅤ、ChinaⅥ属于Asian谱系，China Ⅲ属于Cosmopolitan 谱系，China IV属于Arctic-like谱系[7]。Feng 等[8]2015年在新疆和内蒙地区首次分离到属于草原型进化分支的RABV分离株，该分支属于Cosmopolitan谱系。

RABV的核蛋白(NP)基因相对恒定，在不同病毒株之间高度保守，而且与病毒的型别有关，可以作为群变异的指标，用于RABV感染的诊断、基因分型和进化研究[9]。本研究对3只患狂犬病死亡的美洲驼(Lamaglama)的小脑组织样本进行RABVN基因扩增、测序和遗传进化分析，阐明其遗传进化规律，为狂犬病的防控提供数据。

1 材料和方法

1.1 脑组织样品

3只已被确诊和报道的患狂犬病死亡美洲驼[10]的小脑组织，样品信息见表1。

表1 脑组织样品信息Tab.1 Background information of brain specimens

1.2 引物及主要试剂

RABVN基因特异性引物：上游引物(Nf2)5′-GTCAATAATCAGGTGGTC-3′，下游引物(Nr2)5′-AGCCTAGTGAACGGAAGTG-3′，PCR 产物长度为834 bp[11]。TRIzol Reagent RNA 提取试剂盒和随机引物购自Invitrogen 公司，DNA marker和ExTaqDNA 聚合酶购于宝生物工程(大连)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 RNA提取和N基因扩增

按TRIzol Reagent RNA提取试剂盒使用说明书提取3只美洲驼小脑组织总RNA，以随机引物反转录制备cDNA，按PCR试剂盒说明书进行N基因扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。

1.4 基因测序和遗传进化分析

获得的3个样品PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。测序所得的3个基因片段用DNAStar(Version 5.01，Lasergene，USA)生物分析软件中的MegAlign进行序列分析和比对，用Mega生物分析软件的Maximum Likelihood method绘制系统发育树，分析3株RABVN基因遗传进化规律。代表性参考毒株序列从GenBank 检索获得。

2 结果

2.1 PCR结果

经基因扩增获得3个大小均为850 bp左右的目的条带。

2.2 RABV N基因遗传进化分析

同源性分析表明，这3株病毒间的N基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为100%。进化分析表明，3株病毒株基因序列与2011年呼和浩特奶牛源毒株(cow 96 Hohhot)、2011年呼和浩特犬源毒株(dog 92 Hohhot)、2013年内蒙古牛源毒株(KC465376)、2007年湖北犬源毒株(EU159381)，2016年北京犬源毒株(KY214287)、2018年北京犬源毒株(MK514271)、2006年天津犬源毒株(KT221104)、2009年福建犬源毒株(FJ866827)、2007年河北Homosapiens源毒株(EU267777)和2009年北京Homosapiens源毒株(EU700031)的基因同源率均为100%，位于同一个分支内，均属于Asian谱系。

3 讨论

自2009年以来，内蒙古地区动物狂犬病一直发生，特别是2011—2014年疾病呈多发态势[10-12]。2015年王金玲等[12]报道了2011年流行的2株呼和浩特地区奶牛源和犬源RABVN基因核苷酸序列都属于 Asian 谱系，都与参考的河北(EU267777、EU549783)、山西(GU591790)和北京(EU700031)分离株具有最高的亲缘关系，同源率在99.3%—99.6%，说明这2株病毒的N基因与山西、北京等毒株起源于共同的祖先。2016年周微微等[11]报道了2009—2012年内蒙古地区16株RABVN基因遗传进化分析显示12株毒株属于CTN-1(Asian谱系)，4株毒株属于ERA(Cosmopolitan谱系)。2020年曹霞等[10]报道了2015年确诊的呼和浩特地区3例美洲驼狂犬病自然病例。

人和动物狂犬病绝大多数都是由犬咬伤引起[13]。据现场调查，流浪犬易于进入发病的动物园内，因此，可以推测最早感染RABV的NM11465号美洲驼的发病与狂犬病带毒犬的咬伤有关。被NM11465号美洲驼在发病过程中咬伤的NM11478号和NM11587号美洲驼分别于被咬伤后17 d和29 d发病死亡[10]。本研究的3株美洲驼源RABVs之间N基因核苷酸和氨基酸序列的同源性均为100%，均位于同一个进化分支，都属于 Asian 谱系，说明这3个毒株N基因未发生同义突变[14]。3株美洲驼源RABVN基因核苷酸序列均与2011年呼和浩特奶牛源毒株(cow 96 Hohhot)、2011年呼和浩特犬源毒株(dog 92 Hohhot)、2013年内蒙古牛源毒株(KC465376)、2007年湖北犬源毒株(EU159381)、2016年北京犬源毒株(KY214287)、2018年北京犬源毒株(MK514271)、2006年天津犬源毒株(KT221104)、2009年福建犬源毒株(FJ866827)、2007年河北Homosapiens源毒株(EU267777)和2009年北京Homosapiens源毒株(EU700031)的基因亲缘关系最近，基因序列同源率为100%，均位于Asian谱系。说明这些地区流行的参考毒株起源于同一祖先，且在内蒙古呼和浩特地区一直存在。