单核苷酸多态性微阵列芯片与荧光原位杂交在流产绒毛组织遗传学分析中的比较研究*

黄 艳，王晓华，侯东霞，白瑞芳，侯丽青，冀小平

内蒙古自治区妇幼保健院遗传优生科，内蒙古呼和浩特 010020

临床上常用细胞染色体核型分析来诊断染色体疾病，虽然可以检出所有染色体非整倍体的数目异常及>5 Mb的染色体结构异常[1]，但是传统的细胞培养、染色体核型分析需要的工作周期较长(15个工作日)。荧光原位杂交(FISH)的最大优势在于不仅可用于中期染色体的检测，而且可以用于间期核染色体的检测[2]，同时也弥补了检测周期的缺陷，约3～5个工作日可出结果。然而，FISH技术的高成功率仅表现于对染色体数目异常的检测，不能检测染色体的结构异常[3]。染色体微阵列分析(CMA)技术，包括微阵列比较基因组杂交技术和单核苷酸多态性微阵列(SNP-array)技术，是新近发展起来的一种快速、高效的分子核型分析技术，不仅能检出拷贝数变异(CNVs)，还能检测出杂合性缺失、单亲二倍体和低水平的嵌合体[3-4]。本院自2016年开始开展SNP-array技术，临床应用效果较好，本研究采用SNP-array技术和FISH技术对稽留流产绒毛组织进行检测、比较，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年11月至2019年8月内蒙古自治区妇幼保健院稽留流产的632例患者为研究对象。纳入标准：(1)符合稽留流产相关诊断标准[5]；(2)23～40岁；(3)流产孕周6～13周。排除标准：(1)有子宫内膜异位症、子宫肌瘤等影响胚胎着床、发育的因素；(2)男方精子不成熟[5-7]。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2方法 随机选取632例研究对象中181例患者作为试验组，采用SNP-array技术检测胚胎染色体；另选取451例患者作为对照组，采用FISH技术检测胚胎染色体。

试验组：无菌操作下取流产绒毛组织，离心，按总RNA试剂盒(德国Promega公司)要求抽提DNA，测定浓度和纯度。按 Affymetrix Cytoscan 750K芯片的要求对提取的DNA进行操作，通过酶切、连接、扩增、纯化、片段化、标记，与Affymetrix Cytoscan 750K芯片进行杂交、孵育、洗涤、染色。采用 Affymetrix Genechip Scanner 3000Dx扫描系统对数据进行采集，CHAS软件进行分析。

对照组：去除蜕膜、血块等杂质后，挑选绒毛组织5 mg剪碎成绒毛枝，进行消化、预固定、固定，将固定后的细胞悬液滴片，在73 ℃烤箱中烤片30 min。将制备好的玻片进行漂洗、消化、脱水后，加探针，76 ℃变性7 min后迅速置于37 ℃的水浴箱中，杂交前取出。选用特异性探针进行杂交过夜(条件42 ℃)。荧光显微镜下细胞计数>100个，当检测到染色体异常>60%时为阳性，提示异常标本；<10%为阴性，提示正常标本；在10%～60%为嵌合体。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理分析。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组检出染色体异常的种类 采用SNP-array技术成功检测试验组181例患者的绒毛组织，其中检出染色体异常104例(57.46%)，包括非整倍体83例，整倍体10例，微缺失微重复CNVs 11例(2例CNVs致病性不明确的病例，夫妇拒绝芯片验证，故无法获得遗传学来源)。对照组检测451例，绒毛组织标本的间期FISH均获得杂交信号，其中检出染色体异常197例(43.68%)，包括非整倍体177例，整倍体20例。与对照组比较，试验组对染色体异常的检出率更高，差异有统计学意义(χ2=9.829 7，P<0.05)。

2.2两组染色体非整倍体异常的检出情况 试验组非整倍体异常标本中，最常见的为16-三体，共16例，另有22-三体10例(含1例嵌合)，21-三体6例(含1例嵌合)，13-三体5例(含1例嵌合)；单体主要发生在X染色体(共10例)。对照组非整倍体异常标本中，以16-三体最多，共105例，另有45,X染色体30例，22-三体18例，21-三体11例，13-三体6例，18-三体3例，嵌合体及其他染色体异常4例。见表1。

2.3试验组染色体微缺失微重复的检出情况 试验组中4例单一位点缺失或重复标本中，缺失2例，其中8号染色体缺失1例，17号染色体缺失1例；单一位点重复2例，其中X染色体重复1例，13号染色体重复1例；7例标本同时具有2个或2个以上的位点缺失或重复。另有结果显示，试验组SNP-array技术检测出13q13.3q34二体、三体嵌合；对照组FISH检测出16-三体和45,X染色体。见表2，图1、2。

表1 两组染色体非整倍体异常的检出情况[n(%)]

表2 试验组染色体微缺失微重复的异常情况

图1 FISH检测16-三体

图2 FISH检测45,X染色体

3 讨 论

SNP-array技术可发现所有的染色体数目异常，可以识别并检测染色体的重排，包括基因组序列的获得与丢失，并且其可有效检测出基因组所存在的不平衡问题[8-9]。SNP-array技术是通过检测DNA CNVs实现的，结论可分为良性、可能良性、不明确、可能致病和致病5种类型[10]。结合基因组变异数据库(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、人类染色体失衡和表型数据库(https://decipher.sanger.ac.uk/)，以及专门收录于基因组中(包括CNVs里可遗传的或遗传性基因疾病)的在线孟德尔遗传性疾病数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)，可获取具体的基因序列、位点、疾病及相关研究[11-12]，可以在线查询相关CNVs的信息。SNP-array芯片检测不能识别如下染色体异常：(1)平衡易位、倒位携带者；(2)低比例嵌合体者(嵌合率低于30%)。FISH技术是利用荧光标记的DNA探针与待测标本DNA序列进行杂交，针对常见的染色体非整倍体(13、16、18、21、22-三体及性染色体数目异常)，根据杂交信号的有无及类型达到诊断目的[13-15]。本研究通过SNP-array技术与FISH技术检测流产绒毛组织，得出如下结论。

SNP-array技术的检测范围及检出率高于FISH技术。孕妇发生自然流产的病因很复杂，胚胎或胎儿染色体异常是早期流产最常见的原因，约占50%～60%[16]。染色体数目异常是引起自发流产的最主要遗传因素[17]，本研究表明，试验组染色体数目异常(非整倍体和整倍体异常)共93例，占所有染色体异常的89.42%。FISH技术作为一种靶向检测技术，不能对整个染色体组进行检测。由于方法学的限制，FISH技术只能检测13、16、18、21、22及性染色体的数目异常，其他染色体异常则无法检测，也无法检测这6条染色体探针区域以外的片段是否发生了缺失、重复、易位或倒位[18]。本研究中FISH技术对染色体异常的检出率只有43.68%(197/451)；而SNP-array技术可发现所有的染色体数目异常，染色体异常的检出率为57.46%。试验组中除染色体数目异常还检出CNVs 11例，其中5例为常规染色体核型分析无法发现的<10 Mb的CNVs。2例CNVs意义未明，需要夫妻双方进行SNP-array技术验证，只有检测其来源，才能为下次妊娠提供指导，但夫妇拒绝验证，因此无法进一步明确结果。试验组对染色体异常的检出率高于对照组，差异有统计学意义(χ2=9.829 7，P<0.05)。

流产胚胎染色体以16-三体、22-三体和45，X染色体最常见。本研究中，试验组用SNP-array技术检出的染色体异常包括非整倍体、整倍体及染色体微缺失和微重复，其中染色体非整倍体发生率最高。试验组染色体非整倍体异常的发生率为79.81%(83/104)，染色体非整倍体异常又以16-三体最为常见，22-三体和45，X染色体的发生率并列排第2位。对照组中染色体非整倍体异常的发生率为89.85%(177/197)，FISH技术检测到的染色体异常以16-三体为最常见，其次是45，X染色体和22-三体，发生率排第2位和3位。

综上所述，在检查自然流产妊娠物染色体异常的效果上，SNP-array技术明显优于以往的FISH技术，值得临床应用推广。该技术在自然流产分子遗传学分析中有显著优越性，因此，有必要对稽留流产患者进行SNP-array技术检测，不但可以明确病因，更能为患者提供遗传咨询和再生育指导[19]。