骨髓瘤诊断及预后评估的新标志物-胞外囊泡

刘晓莉 周林 韩崇旭

1大连医科大学研究生院（辽宁大连116044）；2扬州大学附属苏北人民医院医学检验科（江苏扬州225001）

骨髓瘤，又称多发性骨髓瘤（multiple myelo⁃ma，MM），是以骨髓中克隆性浆细胞增殖紊乱为特点的恶性血液系统疾病，在血液系统肿瘤中发病率排名第二［1-2］。随着国内人口的老龄化，该病的发生率也逐年上升。目前，MM是通过骨髓中克隆性浆细胞的数量、M蛋白的浓度水平以及相应的临床症状（高钙血症、肾损伤、骨质破坏和贫血）进行诊断，患者一旦被确诊为MM，均已出现不同程度的器官损伤，严重影响患者的预后［3］；此外，难治、易复发使MM至今仍成为不可治愈的血液系统疾病［4］。因此MM的早期诊断和预后监测对MM患者的生存就显得尤为重要。胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞分泌的一种膜性囊泡［5］，其内容物中含有丰富的蛋白质、非编码RNA（non⁃coding RNA，ncRNA）、脂质、细胞因子、酶等具有生物学活性的分子，这些分子的存在可在一定程度上反映其所来源的细胞特性［6］。当骨髓微环境中的EVs与克隆性浆细胞相互作用时，克隆性浆细胞通过对EVs的识别、内化等过程诱导自身的增殖分化［7］，表明EVs在MM的发生、发展中扮演着重要的角色。

1 胞外囊泡的生物学特性

EVs现有的分类主要依赖于囊泡体积大小和生物学发生机制［8］。最新的研究表明，EVs的两个主要类别是囊泡体和外泌体，囊泡体主要包括微粒和微囊泡，其发生机制目前认为是细胞通过质膜直接出芽释放而来，大小范围为50 nm至1mm；而外泌体的发生机制则更为复杂，其是细胞通过胞吞作用后，在胞质内经过早期分选内体、晚期分选内体最终形成包含有多个管腔内囊泡（intralu⁃minal vesicle，ILVs）的多泡体，当多泡体与质膜发生融合后，通过胞吐作用将ILVs释放到细胞外，释放到细胞外的ILVs被称为外泌体，直径约为30～160 nm［9］。

由于EVs在细胞外环境中的广泛存在，且依靠其独特的脂质双分子膜结构、纳米级的体积以及内容物中含有的丰富的生物活性物质，因此，EVs具有发挥调控细胞间生物学作用的独特优势。现有的研究表明，EVs可分别通过下述三种不同的途径来调控受体细胞：（1）可通过吞噬和胞饮作用被受体细胞特异性摄取；（2）可通过受体⁃配体作用被受体细胞捕获；（3）可通过与受体细胞质膜之间的直接融合；当EVs被靶细胞内化后，EVs中的内容物会通过溶酶体逃逸的间接途径被转运到胞核或胞膜，从而发挥调控受体细胞的生物学功能的作用［10-11］。EVs的这一特性，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用［12］。

2 胞外囊泡对多发性骨髓瘤发生、发展的影响

最新的研究表明，骨髓瘤细胞衍生的EVs能被骨髓瘤微环境中的特定细胞摄取［如NK细胞、髓源抑制性细胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）、骨髓间充质干细胞（bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells，BMSCs）、内皮细胞、成骨细胞和破骨细胞等］，并改变上述细胞的生物学特性，形成有利于骨髓瘤细胞增殖、分化的骨髓微环境，从而对MM患者产生局部或全身性的影响，与此同时，骨髓中各类基质细胞衍生的EVs被骨髓瘤细胞摄取后，能够促进骨髓瘤细胞发生远处转移、加剧骨质破坏、药物耐受等［13］，最终导致骨髓瘤患者的进展。

2.1 胞外囊泡促进骨髓瘤患者的免疫抑制MM患者骨髓中各类细胞来源的EVs对机体发挥着负向免疫调节的作用，促进了疾病的进展。文献报道，MM患者的BMSCs来源的EVs可诱导外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD3+和CD4+淋巴细胞凋亡，促进具有负向免疫调节作用的调节性T细胞的分化、增殖，引起具有免疫抑制作用的炎性因子IL⁃10的浓度升高，从而加剧了MM患者的免疫抑制，促进了骨髓瘤细胞的免疫逃逸［14］；同样，WANG等［15］在荷瘤小鼠模型中的研究发现，BMSCs来源的EVs，通过活化MDSCs的STAT3、STAT1等信号通路，促进了MD⁃SCs的增殖和活化，并通过上调抗凋亡蛋白Bcl⁃xL和Mcl⁃1的表达，抑制MDSCs的凋亡，促进了MD⁃SCs细胞的免疫抑制功能，从而加速MM的进展。

2.2 胞外囊泡促进骨髓瘤远处转移、骨质破坏及治疗耐受在缺氧环境下，骨髓瘤细胞释放的高表达miR⁃135b的EVs，被内皮细胞内化后，可下调低氧诱导因子抑制因子（factor⁃inhibiting hypoxia inducible factor1，FIH⁃1），并通过HIF⁃FIH信号通路增加内皮血管的形成，促进了MM的远处转移［16］；此外，EVs还可以加剧上皮间质转化，促进MM的转移与扩散［17］。骨髓瘤细胞来源的外泌体中含有具有生物活性的lncRNARUNX2⁃AS1，并可以传递给间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs），在MSCs中lncRNARUNX2⁃AS1与pre⁃RUNX2形成RNA双链，阻止mRNA的剪切，并以一种负反馈的方式调节RUNX2 mRNA和蛋白表达，降低MSCs向成骨细胞转化，从而抑制骨的生成［18］；FAICT等［19］从5TGM1小鼠骨髓瘤模型的研究中发现，骨髓瘤细胞来源的EVs可调节成骨细胞活性与功能，抑制成骨细胞分化。此外，EVs还参与了MM耐药性的产生。ZHANG等［20］研究表明，MM患者硼替佐米的耐药性的产生可能与外泌体中的miR⁃16⁃5p、miR⁃15a⁃5p和miR⁃20a⁃5p、miR⁃17⁃5p的下调有关。总之，EVs通过促血管生成、抑制骨合成、调控治疗耐受等途径，促进了MM的发生、发展。

3 胞外囊泡作为新型液体活检标志物在骨髓瘤早期诊断和预后评估中的研究进展

细胞主要通过运输所需的内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依赖或ESCRT非依赖途径调控不同类型EVs的释放以及其内容物分子的分选和装配，从而导致EVs既具有与来源细胞的同源性，同时也具备有别于来源细胞的独特性，因此，EVs作为疾病诊断和预后评估的新型液体活检标志物备受关注［21］。在实体肿瘤领域，已有相关的研究表明特异性EVs群在胰腺癌、肺癌等疾病的诊断和预后评估中有重要的价值［22-23］。而在血液系统肿瘤的研究中，EVs在B细胞恶性肿瘤中已经取得一定的研究进展［24］。骨髓瘤患者的临床表现较为多样化［25］，在临床诊疗中很容易出现误诊和漏诊，且现有的有创诊断方式会给患者带来巨大的痛苦，因此更加需要发现具有特异性的、能够反映骨髓中克隆性浆细胞增殖情况的新型标志物来解决上述问题。

3.1 胞外囊泡作为骨髓瘤患者早期诊断的新型液体活检标志物研究发现，与健康对照组相比，MM患者外周血中的总的EVs，尤其是CD138+EVs的数量显著升高，提示CD138+EVs可作为MM诊断的一个新的实验室指标，且该群EVs数量较血清M蛋白能够更为敏感地反映患者的治疗效果及复发监测［26］。也有研究发现，MM细胞释放的外泌体可表达肿瘤B细胞的免疫球蛋白B细胞受体（Ig⁃BCR），其可以被独特型结合肽（Id⁃peptide）靶向结合，研究者使用5T33MM细胞表达的Ig⁃BCR作为诱饵，通过筛选噬菌体展示文库来选择Id肽，筛选出p5肽作为特异性肽结合物，结果证明利用独特型结合肽检测血清中MM细胞来源的外泌体比传统的M蛋白检测能更早的发现MM细胞的存在，提示p5肽阳性的外泌体可作为MM患者的早期诊断新型生物标志物［27］。除了上述具有独特表型的EVs在MM的早期诊断中具有重要作用以外，EVs内容物中的非编码RNA（ncRNA）及某些具有特定功能的蛋白质也对MM早期诊断具有提示作用。在ncRNA领域，目前研究最多的为MicroRNA、lncRNA等，研究显示，外泌体中的miR⁃21、miR⁃164a的表达水平在MM的诊断中也有重要的作用［28］。SEDLARIKOVA等［29］研究发现，外周血外泌体中的lncRNAPRIN对MM及意义未名的单克隆丙种球蛋白血症（monoclonal gammopathy of un⁃determined significance，MGUS）的诊断敏感性和特异性分别为84.9%、83.3%，其中PRINS对MGUS具有更高的诊断效能，提示血清外泌体中的lncRNA PRINS可成为MGUS辅助诊断的新的实验室指标。此外，在对EVs内容物进行蛋白质组学的研究中，研究者发现MM患者外泌体中含有高表达的酪氨酸蛋白激酶（c⁃src），而在正常人及MGUS患者的外泌体中却未见该蛋白的表达，提示外泌体中的c⁃src不仅可用于MM诊断，更可作为MGUS与MM患者鉴别诊断的高特异性的新型标志物［30］。EVs作为新型的液体活体标志物与传统的MM诊断手段相比，能够更早期、更特异的辅助诊断MM，且通过外周血样本的检测就能实现，减少患者行骨髓穿刺手术的痛苦。

3.2 胞外囊泡作为骨髓瘤患者预后评估的新型液体活检标志物一般情况下，影响骨髓瘤患者预后的因素，主要包括宿主因素、肿瘤特征和治疗方式［31］，目前，对于EVs的研究更多的集中在肿瘤特征这一方面。MANIER等［32］分析了156例新诊断的MM患者，发现MM患者外周血外泌体中的22个miRNA水平显着低于健康者，其中let⁃7b、let⁃7e、miR⁃106a、miR⁃106b、miR⁃155、miR⁃16、miR⁃17、miR⁃18a和miR⁃20a被确定为无进展生存的重要预测指标，而let⁃7b和miR⁃18a是总生存率重要的预测因子，且let⁃7b或miR⁃18a的低表达与ISS高的分期显著相关。ZHANG等［33］研究也证明，在ISS分期中，Ⅰ期患者let⁃7d⁃5p和miR⁃425a⁃5p的表达水平明显高于Ⅱ期和Ⅲ期患者；与肾脏未损伤的患者相比较，发生肾损伤患者的let⁃7c⁃5p，let⁃7d⁃5p 5p，miR⁃140⁃3p，miR⁃185⁃5p和miR⁃425⁃5p降低；具有高水平的IL⁃6患者显示出let⁃7c⁃5p，miR⁃140⁃3p，miR⁃185⁃5p和miR⁃425⁃5p的低表达，这些结果表明，外泌体miRNA表达的下降可能与骨髓瘤临床症状的发展和疾病的进展有关。lnc00461在MM细胞及MSCs中高表达，MSCs通过外泌体向MM细胞传递lnc00461，抑制MM细胞中的miR⁃15a和miR⁃16的表达，从而上调了MM细胞的BCL⁃2的表达，促进MM细胞的增殖，抑制其凋亡；研究结果还证实MSCs来源的外泌体中的lnc00461与MM患者的生存率及预后密切相关，与lnc00461低表达组相比，高表达组患者有较差的生存结果的表现［34］。XU等［35］研究也发现，lncPSMA3⁃AS1和PSMA3在硼替佐米耐药的MSCs来源的外泌体中表达增加，通过检测外泌体中lncPSMA3⁃AS1和PSMA3可评估应用硼替佐米治疗后对疾病的改善情况，提示循环外泌体中的lncPSMA3⁃AS1和PS⁃MA3有望成为除国际分期系统外的一种新型预后分层指标。还有研究发现piRNA823主要在MM患者外周血的EVs及MM细胞衍生的EVs中富积，发现piRNA⁃823在ISS分期中II期和III期患者的外周血中显著增加；血清EVs中piRNA⁃823的增加与传统标志物β2⁃MG（r=0.800，P<0.01）呈正相关，提示EVs中的piRNA823可作为一个新型的预后监测指标［36］。

在蛋白质分析领域，通过蛋白质组学评估发现EVs中的各类蛋白与MM患者预后的相关性。HARSHMAN等［37］研究发现，CD44在皮质类固醇抵抗性MM.1R细胞系的EVs组分中特别富集，同时其在MM患者血清来源的EVs中高表达，且CD44的高表达与MM患者的总体生存率呈负相关，提示CD44也是一种MM患者的预后监测指标。近年来的相关研究表明，EVs不仅可作为MM早期诊断标志物，在患者的分期、生存预测中也具有重要意义。基于EVs独特的生物学特性，使用EVs作为诊断后预后评估的生物标志物具有明显优势，其可通过外周血直接被检测，可重复性高，给患者带来的痛苦较小，且与传统实验室诊断方法相比，能够更为特异性的反映骨髓中克隆性浆细胞的增殖情况。

4 总结与展望

截止目前，有关EVs在MM中的研究，仍较多的集中在以细胞、动物模型为平台的基础机制研究方面，而应用EVs作为MM患者诊断及预后监测的新型液体活检标志物的临床研究则较为少见。究其原因，主要是由于EVs的分离方法众多且难以做到标准化，不同分析方法分析结果的一致性、再现性较差。有文献报道，研究者们使用不同的分离方法会导致EVs及其RNA的浓度、纯度或大小存在差异［38］。除此之外，在使用EVs相关的内容物（如DNA、RNA、蛋白质等）作为标志物研究时，应尽可能的选择纯度较高的提取EVs的方法，且由于患者血清或血浆中存在多种的可溶性蛋白或游离DNA或RNA，这些蛋白或DNA、RNA可能会对研究结果产生正向或负向的影响，因此在实验过程中应尽可能证明被研究的标志物是来自EVs，以免造成研究者得出错误的结论［39］。上述原因也成为了研究者们开展针对特异性EVs或EVs中的特异性表达的内容物的临床研究难以逾越的障碍。

此外，EVs至今未应用于MM的临床诊断和预后评估，其中最为重要的原因在于，研究者们还没有能够通过实验研究，在外周血中找到与骨髓中克隆性浆细胞呈高特异性相关的胞外囊泡群，不过随着EVs分离纯化方法标准化、各种更为先进的检测技术的不断涌现，特异性EVs终将会成为一个MM诊断和预后评估的新型液体活检标志物。