胃癌细胞增殖机制的研究进展

赵晨昕，王志刚，杨霞

(天水市中医医院，甘肃 天水 741000)

0 引言

胃癌是消化道肿瘤的常见肿瘤。据全球统计，2018 年2200 万例新发感染引起的癌症中仅中国占比35%，其中42%是由于幽门螺杆菌(HP)感染[1]。胃癌的发生发展与信号通路密切相关，但是在过去的几十年中，研究似乎主要集中在仅针对单一路径上，因此忽略了与整个过程相关的信令串扰网络系统的巨大复杂性。因此，探索信号级联的交叉调节将提供对系统中信息传导的更全面的理解。因此，鉴定和阐明介导细胞信号转导途径内的串扰的关键分子将为设计更有效的癌症治疗方案提供新的机会。本为以胃癌为例，综述胃癌的增殖与信号通路的研究进展，为胃癌的药物研究提供思路。

1 PI3K/Akt 信号通路

PI3K 是PI3K/Akt 信号通路中最重要的分子，其可磷酸化细胞膜上磷脂酰肌醇，被磷酸化的磷脂酰肌醇为许多蛋白激酶提供锚定点，活化的蛋白质激酶可进一步激活下游信号分子，其中Akt 是下游信号中的一个分子。Akt 的活化能够促进细胞的生长增殖及存活[2,3]。Wang Q 等[4]使用生物信息学和抑制剂处理的机制探索表明，PI3K / AKT / mTOR 信号传导可能与CLEC5A 介导的胃癌发生有关。此外，PIK3AP1 激活了胃癌中的Akt 磷酸化，PIK3AP1 表达与p21 的蛋白质表达呈负相关，而与GC 细胞中CDK4，CDK6 和CyclinD1 的蛋白质表达呈正相关[5]，从而促进了胃癌细胞的增殖。

2 Wnt/β-catenin 信号通路

在经典的Wnt/β-catenin 中β-catenin 在细胞质与细胞核中的富集与降解是该条信号通路激活与否的关键事件。当Wnt与细胞膜表面Frizzled 和LPR 结合，磷酸化β-catenin 复合物中Axin 释放β-catenin 进入细胞核与转录因子TCF 结合激活下游靶基因的表达。而非经典途径具有Ca2+响应性，并导致Rho相关蛋白激酶(ROCK)和c-Jun N 端激酶(JNK)介导的细胞骨架重排以及目标基因的转录激活。不同的Wnt 信号对细胞的增殖具有不同的作用。Wen[6]通过无标记的定量蛋白组学研究了NCI N87、MKN 45、MKN28、BGC823、MGC803 和SGC7901六个胃癌细胞系，发现在MKN 45 及NCI N87 中Wnt3α、FZD6及CTNNB1 增加，GSK-3β减少，促进了细胞的增殖和侵袭，通过Wnt/β-catenin 抑制剂抑制Wnt/β-catenin 途径，降低了细胞的增殖和侵袭。同时，Wang[7]研究表明胃癌中Wnt3 的上调能够诱导胃癌细胞的增殖、迁移并抑制癌细胞的凋亡。莫丽[8]证实了抑制Wnt3 的表达能够抑制胃癌细胞的增殖侵袭能力。但是，Wnt7α在不同的肿瘤类型中通过激活经典和非经典wnt/β-catenin 信号通路扮演者抑瘤和促瘤截然不同的作用。而在胃癌中，王淑坤[9]采用实时荧光定量PCR 技术及Western blot技术检测胃癌组织中Wnt7αmRNA 及蛋白的表达变化发现，Wnt7α的高表达对SGC7901 细胞的增殖、迁移和侵袭有明显的抑制作用，而低表达Wnt7α的胃癌瘤体体积大、淋巴结转移率高。

3 Hedgehog 信号通路

HH 信号通路有Ptc 及Smo 两种跨膜蛋白受体，Ptc 主要在细胞膜富集，Smo 存在于细胞内的膜泡上。Gli(Gli1/2，Gli3 是转录阻遏物)的完整性与否是该信号通路能否被激活的关键蛋白。无HH 信号时，Gli 被Fu 及Cos2 磷酸化水解为GliR，进入细胞核内抑制下游基因的表达。存在HH 信号时，Ptc 被降解，对Smo 的抑制作用被消除，使得Smo 转移至细胞膜上被PKA 及CK1 磷酸化，被磷酸化的Smo 磷酸化Fu 及Cos2，使Gli从微管上解离，以全长的形式进入细胞核与转录激活子CREB结合蛋白结合，并结合到靶基因一段保守序列5’-TGG GTG GTC-3’上，开启靶基因(Ptch1 及细胞增殖调控的相关CylinD、CylinE、Myc、P21 及自身Gli 等基因)的表达[10-13]。虽然经典路径遵循所讨论的Ptch1-Smo-Gli 轴，但非经典路径却独立于Smo，允许Gli1/2 转运至细胞核以使其作为转录因子的活性的任何途径均归类为非经典途径。这些可能是由诸如KRASMAPK / ERK，TGF-β，IGF，PI3K-AKT，TNF-α诱导的mTOR / S6K1、EGFR、Notch 以及hSNF5(也称为SMARCB1，被称为染色质重塑的调节剂)激活[14,15]。胃癌肿瘤标本免疫组织化学显示Gli1 阳性为57.8%(59/101)，SHH 染色为71.3%(72/101)，Gli与SHH 的过表达与肿瘤的大小、侵袭力及低分化有关[16]。

4 JAK-STAT 信号通路

STAT 蛋白是JAK-STAT 信号通路中调节细胞分化、增殖、炎症和凋亡的重要转录因子，这一级联受到三类主要负调控因子，蛋白质酪酸激酶(PTP)、细胞因子信号抑制物(SOCS)和活化STAT 蛋白抑制剂(PIAS)。负调控因子水平降低，该通路被异常激活与多种病理有关，包括免疫系统紊乱和癌症的发生[17]。各种体内体外实验证明JAK-STAT 信号失调发生在血液肿瘤及各种实体瘤中。许多研究表明JAK-STAT 信号失调参与了胃癌的发生发展[18,19]。Woo[20]等对285 例胃癌标本进行免疫组织化学分析，研究了STAT3 与细胞周期蛋白D1、P21、P27、缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的关系，证实了STAT3的激活是胃癌发生的早期事件，与胃癌细胞的增殖及血管的生成密切相关。Wu[21]等研究了胃癌细胞系(HGC27，SGC790和BGC823)蛋白质酪酸磷酸酶、mRNA 及STAT3 的表达发现，胃癌中蛋白质酪酸磷酸酶及mRNA 表达下调，STAT3 活性增加，显著促进了胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。尽管STAT3 的激活能够刺激肿瘤的生长，然而，最新研究表明IL-21 通过激活STAT1 而产生IFNγ发挥抗肿瘤作用，抑制STAT1 的激活和INFγ的产生能够促进肿瘤的生长[22]。由于肿瘤微环境存在细胞因子及生长因子，因此会产生大量的STAT3 因子，较少的STAT5 因子[23]，该途径介导癌细胞多种细胞因子信号转导，主要促进细胞增殖、迁移和新陈代谢。此外，STAT3 作为细胞调节的中心蛋白之一，其与EGFR[24]、RAS-RAF-MPKA[25]、Src[26]、Wnt[27]、cMET[28]和TGF-β[29]信号途径相互作用，促进癌症的生长。

5 TGF-β 信号通路

经典的TGF-β信号通路依赖于Smad 蛋白家族，Smads 被细胞表面具有活性的TGF-β1 受体磷酸化。其中Smad2/3/5/8介导该通路的激活，Smad4 充当辅助因子与激活的Smad 分子形成复合物移位至细胞核调节转录[30]。Smad7 可通过TβR1和Rsmads 相互作用抑制TGF-β信号转导。此外，Smad 泛素调节因子介导TβR1 降解动态调节TGF-β信号转导[31,32]。TβRs 还可激活非Smad 依赖性分子，包括P38，c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及NF-κB 介导的有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[33]，非Smad 依赖途径与Smad 依赖途径共同调节TGF-β信号转导活性。该通路的负调控因子有磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、蛋白质磷酸酶镁1A(PPM1A)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、SMAD7 以及骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂(BAMBI)[34]。有临床试验证明胃癌患者体内TGF-β表达水平较正常人高[35]。Tang J 等[36]研究发现胃癌细胞通过调节TGF-β/上皮间质转化(EMT)促进自身生长转移，骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂的过表达下调了编码TGF-β信号转导途经区域的DNA 甲基化，从而抑制了胃癌的增殖和转移。Ouyang S 等[37]研究表明转化生长因子-β(TGF-β)诱导了GC 细胞中同源蛋白Bapx1 表达和上皮-间质转化(EMT)，而下调的Bapx1 逆转了TGF-β诱导的胃癌增殖、侵袭和迁移。同样，Wang 等[38]也证实了MFAP2 促进了GC 细胞的增殖，迁移，侵袭和上皮-间质转化(EMT)表型，其机制通过激活TGF-β/ SMAD2 / 3 信号通路来调节GC 细胞的EMT。有研究表明Smad4 的单倍体缺失会引发小鼠胃息肉病和胃癌[39,40]，而尚未有充分证据证明Smad2 及Smad3 在胃癌中突变，可能因为40%的人胃癌组织中Smad3 表达较低甚至无法检测有关[41]。

6 Notch 信号通路

Notch 信号发生在接触的细胞中，一个细胞在其表面显示跨膜Notch 特异性配体(Delta 型配体和锯齿状)，而另一个细胞则显示跨膜Notch 受体[42]。该相互作用是由Notch 受体在配体接触后的两个随后的裂解事件介导的，两者均由重要的蛋白酶介导。第一次切割是由ADAM(一种整合素金属蛋白酶)酶(ADAM 10 或 ADAM 17)(也称为TACE-肿瘤坏死因子-α转化酶)，从而切割出Notch 细胞外域(NECD)；第二个裂解事件是由γ分泌酶介导的，该酶裂解并释放Notch 细胞内结构域(NICD)，然后直接转移到细胞核中以激活Notch 靶基因的转录。Notch 信号级联中也存在规范和非规范途径。已经表征了五个典型的Notch 配体-Delta 样配体1、2、3 和4(DLL1，DLL2，DLL3 和DLL4)以 及Jagged1 和Jagged2。此外，目 前有四个Notch 受体旁系同源物-Notch1，Notch2，Notch3 和Notch4。显然，Notch 途径是复杂且功能多样-不同的细胞可以表达不同的Notch 受体和配体。Notch 的非规范途径可能与癌症的发展和维持有关[43]。Chung W C 等[44]揭示了在Kras 驱动的胃肿瘤发生过程中Notch 信号和Mist1 表达的下调，并提示Notch 在这方面具有抑癌作用。

7 NF-κB 信号通路

核因子κB(NF-κB)家族包括5 个亚型：Rel、P65、RelB、P50 及P52，其中Rel、P65 及RelB 有共同转录激活区[45]，P50及P52 有共同的转录抑制区。NF-κB 是介导细胞活化，增殖，存活和效应子功能的关键调节因子，IκB 激酶(IKK)复合体将这些转录因子与受体连接，IKK 复合物包含NEMO(IKKγ)和其他两个IKK(KKα、IKKβ)[46]。激活IKK 复合物后，IKK2 主要磷酸化NF-κB 抑制剂(IκBα，IκBβ和IκBε)，后者在多泛素化后被蛋白酶体降解[47]。抑制剂的降解可以使NF-κB 发生核转运，并调节靶基因的转录。NF-κB 的靶基因非常广泛，包括促凋亡因子(Bax、死亡受体Fas、P5、癌蛋白-myc 等)、抑凋亡因子(Bcl-2、Bcl-Xl、TNF-α等)、细胞周期控制因子(周期素D1、周期素D2、周期素D3 等)、生长因子、黏附分子、促转移因子和促血管生成因子。因此NF-κB 的激活不是单纯的促进或者抑制，而是双向调节。例如，活化的NF-κB 在细胞核内与cyclinD1 基因启动子NF-κB 位点结合，激活cyclinD1 的转录，促进细胞G1/S 期进程[48]；可下调生长抑制和DNA 损伤诱导基因45，恢复cyclinD1 活性，促进细胞通过G2/M 检验点，促进细胞增殖。但是，当NF-κB 家族成员c-Rel 在细胞中高表达时，c-Rel 可与CDK2 的调节亚基cyclinE 结合并同时抑制CDK2和NF-κB 的活性，细胞周期就被阻滞在G1/S 期。细胞周期功能的紊乱，特别是细胞周期检验点功能的缺陷，是细胞失控性增殖的生物学基础，而细胞的失控性增殖，对肿瘤的发展起到了有力的推动作用。诸多研究表明[49]细胞的失控性增殖与NF-κB 信号途经的异常转导密切相关，在癌症中经常被激活，并广泛调节癌细胞的增殖。Xu Y H 等[50]发现IFN-γ通过整联蛋白β3 促进p65 和IκBα的磷酸化，激活NF-κB 通路，促进胃癌细胞的增殖、迁移并抑制凋亡。

8 各通路之间串扰对胃癌增殖的影响

到目前为止，已知Wnt 和HH 信号互相串扰主要通过HH转录因子Gli1 诱导的内源性分泌型卷曲相关蛋白1(sFRP1)介导的。sFRP1 是Wnt 的负调控因子，因为它通过Wnt 蛋白选择性非共价结合抑制Wnt 信号的级联反应[51]。HH 上调sFRP1抑制Wnt 信号，从而抑制β-catenin 的转录活性。据此，可以推断Wnt 是HH 的下游信号级联。Gli1 的过表达会抑制Gli3R mRNA、Wnt、SHH、SFRP1 及snail 的转录。

Gli1 诱导snail 的表达，snail 与β-catenin 相互作用并刺激其转录活性[52]。Gli1 的靶蛋白是Wnt2b，Wnt4 和Wnt7b[53]。Gli1 还可以上调Shh 的表达，Shh 的分泌以旁分泌方式作用于周围的基质细胞。基质细胞在对Shh 作出反应时会增加Foxf1和Foxf2 的表达，进而抑制Wnt5a 的间质表达并导致β-连环蛋白的抑制[54]。与HH 途径一样，Notch 途径也通过酶和信使分子与Wnt 途径串扰。已经发现Wnt 靶基因如CD44 的表达先于Notch 特异性靶基因如Hes-1 的表达。研究胃泌素释放肽前体对Notch 途径作用机理的实验表明[55]，β-catenin/ TCF-4 级联发生在胃泌素释放肽前体的下游，并可以通过调控Jagged-1刺激Notch 信号通路。此外，已经发现，Notch 的激活通过不明机制对Wnt 信号维持了积极的作用。胃泌素前体激活这两个途径对于通过破坏增殖与分化/凋亡之间的精细调节的致癌作用至关重要。IL-6 是NF-κB 和JAK/STAT 信号途经串扰分子，NF-κB1 的缺失致STAT1、STAT3 mRNA 的表达增加，促进了胃癌的发生，而STAT3 等位基因的缺失虽然能够减轻NF-KB1缺失的小鼠胃炎病理情况，但不能阻止胃癌病理的发生，STAT1的等位基因缺失对胃癌的病理不产生任何影响，NF-κB1 的丢失与STAT 的异常激活具有协同作用，共同促进了胃炎及胃癌的发生[56]。串联的直接证据显示抑制p-STAT3 /NF-κB(p65和p50)和Bcl-2，能够增强类黄酮(TXN)对5-FU 耐药的胃癌细胞抗肿瘤作用[57]。遗憾的是，关于其他信号通路串联的机制在胃癌中报道极少，但已证实了在其他癌症中的串联，如PI3K / AKT 途径在EGFR 和SHH 诱导的Hh 信号传导中起重要作用，并且PI3K / Akt 和MEK / ERK 途径均在Gli1 水平上与Hh 协同作用，以促进食管癌细胞的增殖和存活。在食管癌的第二种模型中，激活的mTOR / S6K1 被证明可以使Gli1 磷酸化，从而使其从SUFU 中释放出来，从而激活Gli1 靶基因并增强致癌作用[58]。

9 小结

对各种信号通路的机理研究一次又一次地表明，它们并不是独立运行的，而是通过串扰共同发挥作用，并在细胞内形成一个复杂的“信号网络”。这不仅可以同时介导多种细胞功能，而且还有助于组织内细胞多样性的增加，这在胚胎发生和组织维持过程中必不可少，并且有时可导致恶性肿瘤期间干细胞的生长和维持。以Wnt 途径为例进行说明，Wnt 由HH 通过sFRP1 进行调节，其下游组件Gli1 通过Snail 和Foxf1 和Foxf2以及通过调节APC 进行调节。另一方面，Wnt 通过GSK-3β、K1α和转录产物CRD-BP 调节HH。Wnt 还通过上调Hes-1 来调节Notch。它也可以通过CTNN B1 或其他方式调节Notch 途径，并通过β-catenin 激活Jagged 1。Notch 通过其转录共激活因子Maml1 和Pygo-2 调节Wnt。所有这些串扰途径都被认为是恶性细胞增殖和转移的原因。

随着逐渐阐明不同发展途径在癌干细胞群的发生和维持以及肿瘤复发中所起的作用，已经测试了许多分子作为候选药物，每种分子均靶向级联反应的主要介体。一些众所周知的是针对Notch 途径的γ-分泌酶抑制剂(例如RO4929097)和抗DLL 单克隆抗体，靶向 Hedgehog 途径的SMO 抑制剂(例如贝伐单抗)和抑制Hedgehog 的药物。β-连环蛋白的活性(例如塞来昔布)和抗毛躁抗体(例如OMP-54F28)针对Wnt途径[59,60]。它们中的大多数已获得成功，但是，在许多情况下，干细胞群体得以幸存或发生了肿瘤复发，并且在临床试验中将这些药物与其他药物联合给药显示没有更好的结果[61]，即推测结果表明它们要么没有任何协同作用或累加作用，要么转化的细胞已对途径抑制剂产生抗药性。联合疗法的目的是除了提供最佳的治疗性抗癌益处外，还可能降低耐药性。与之相比，它可通过同时靶向关键途径的单药治疗策略以提高治疗效果，协同或累加效益[62]。

10 展望

信号通路的串扰有力地增加了外部刺激如何引起细胞反应的复杂性，从而给正在研究的药物带来了严峻的挑战。因此，通过鉴定和靶向通过不同信号途径参与串扰的关键酶和分子，也可以提高单一疗法的功效。当串扰信号通路以上下游相关的方式并在特定疾病背景下被视为网络时，可以有效抑制肿瘤的生长。如上所述的Wnt 途径是主要的发育途径，对多种癌症类型的癌症干细胞的出现和维持具有影响。正在开展研究，以鉴定Wnt 途径与其他两个主要调控发育途径HH 和Notch 的串扰点。此外，阐明了各种非经典途径在癌症发展中的作用后，可以设想出更多的靶标来对抗这种疾病。消除癌症干细胞的工作具有广阔的未来前景，因为一旦消除了恶性肿瘤，复发的机会就很小。因此，从某种意义上讲，这将是通过仅直接靶向一个信号来抑制多个信号级联的机会，如果用于联合治疗，它可能会被证明更加有益。因此，目前设计可抑制相互作用的关键途经之间主要串扰成分的药物并研究针对串扰而不是单一途径有望在癌症中成为更好的治疗选择。