肝卵圆细胞的起源、标志物及潜在临床应用

杨芊，张玥，吴佳俊，潘艳芳

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.医学技术学院，陕西 咸阳 712046)

0 引言

哺乳动物的肝脏损伤后具有强大的再生能力，一方面是通过肝细胞的自我更新能力，另一方面便是通过肝卵圆细胞(hepatic oval cells,HOC)的增殖分化能力。即使切除三分之二的肝组织，数周之内肝脏可再生并且恢复到其正常水平。是具有多向分化潜能的肝干细胞，在正常情况下，肝卵圆细胞处于静止状态，不会在正常的成体肝组织内检测到，只要当肝组织受到严重损伤时或者肝再生能力受到抑制时，肝卵圆细胞才会被激活，进一步向肝细胞和胆管细胞进行分化[1]。因此，肝卵圆细胞对于肝再生有着重大的作用。肝卵圆细胞在各种原因所导致的肝硬化，脂肪肝，肝癌等终末期肝性疾病的治疗方面有着广阔的发展前景，但是就目前形势来看，肝卵圆细胞移植此方法仅在动物身上所做实验较多，还没有完全应用于人类临床。但是毋庸置疑的是，肝卵圆细胞无疑是肝移植的一个良好的细胞来源，未来的临床前景是无限的。深入研究肝卵圆细胞的来源、特异性标志物、在肝脏再生中的作用及潜在临床应用非常重要。然而目前研究对肝卵圆细胞的上述生物学特性仍然尚未完全阐明，这严重制约了肝卵圆细胞的应用前景。本文对肝卵圆细胞的起源、标志物、肝再生及临床应用前景进行综述，为该细胞在未来的临床应用提供理论基础。

1 肝卵圆细胞的来源

目前对肝卵圆细胞的存在已经形成共识，但对其起源尚存在争议，主要有以下5 种来源。分别为：(1)胆道上皮细胞；(2)胎儿肝中存在的祖细胞；(3)骨髓细胞；(4)肝星状细胞；(5)成熟的成年肝细胞[2]。

1.1 来源于胆管上皮细胞

许多研究表明胆管上皮细胞在肝脏中起着兼职干细胞的作用。因此，这些分化的细胞可能会在特定条件下获得干细胞样特征[3]。最近的工作有证明了蛋白质标记物在探索肝星状细胞(hepatic stellate ceils，HSCs)的生理功能中的实用性。不幸的是，许多广泛使用的标志物，例如EPCAM(epithelial cell adhesion molecule EPCAM、CD133、Sox9、OPN(osteopontin OPN) 在 受 损肝脏的卵圆细胞和健康肝脏的胆管细胞和/或非实质细胞中均被发现[4-5]。此外，据报道兼性HOC 表达CK19 和MIC1-1C3[5]。上述标记的应用由于缺乏细胞类型的特异性而受到限制。FoxI1 (Forkhead box I 1)，Trop2(encoded by tumor-associated calcium signal transducer 2 Trop2)、Lgr5 (1eucine—rich—repeat—containing G protein— coupled receptor 5)是三个的标记，仅出现在受伤肝脏的卵圆细胞[6]。此外，Foxl1 +细胞和Trop2 +细胞表达EPCAM 和CK19 以及表达Lgr5 的类器官可以从培养中的胆管碎片中生长出来，进一步支持了至少某些类型的肝卵圆细胞可以起源于自胆管细胞。此外，基因表达分析比较了Foxl1 + 的HOC、胆管细胞、肝细胞，结果发现Foxl1 +的基因表达谱肝卵圆细胞类似于胆管细胞而不是肝细胞，从而支持肝卵圆细胞来源于胆管细胞[6]。

此外，许多报告表明，肝卵圆细胞的增殖隔室是与先前存在的小管相连。有趣的是，尽管在正常和受损肝脏中均发现了CD133 +细胞，但只有CD133 +细胞从受伤的肝脏中分离出来的病毒可以自我更新[7]。Kamiya 等人发现健康人体内存在 “胆管细胞前体细胞”[8]。这些细胞在体内可以表达CD13，体内整合素α6(ITGA6 或CD49f)、CD133 和CK19。当这些细胞在体外培养后，它们可以自我更新，并开始表达肝卵圆细胞的标记CD44 和肝细胞的标记白蛋白。这些结果进一步支持了胆管细胞可以作为兼性肝卵圆细胞的前体。

1.2 胎儿肝中存在的祖细胞

肝母细胞是在胎儿肝脏中发现的双能细胞(在小鼠中介于E9.5 和E14.5 之间)，具有在体内分化为肝细胞和胆管细胞的能力。由于肝母细胞和HOC 都有增殖能力，并能够分化为肝细胞和胆管细胞，因此认为肝卵圆细胞起源于肝母肝细胞[9]。事实上胚母细胞和肝卵圆细胞具有相同的标记物，例如δ样1 同源物和甲胎蛋白(AFP)这些都是HOC 来源于肝母细胞的证据。胎儿细胞还具有肝卵圆细胞的其他特征，例如克隆形成性和体内重新填充肝脏的能力。例如，鼠胎儿肝细胞的CD13 + DLK +的细胞具有在培养物中形成聚集的能力[10]，以及来自大鼠胎肝AFP + CK19 +的细胞具有在体内再形成肝脏的能力[11]。大多数研究都没有在健康的未损伤肝脏中观察到CD13 + DLK +或AFP + CK19 +细胞的水平，这反驳了在成年器官中继续存在胎儿成肝细胞。此外，成人肝脏中AFP 的表达不足以证明是来自胎儿肝母细胞的后代，这很可能是在成年兼性肝卵圆细胞中重新激活AFP 启动子(或其他胎儿表达基因的启动子)的情况。

1.3 来源于骨髓

在1999 年，Petersen 等人将雄性大鼠的骨髓移植到雌性大鼠中时，0.14%的肝细胞带有Y 染色体[12]。他们还报道了骨髓来源的细胞能够分化为肝细胞，尽管它们对肝实质的贡献程度不到1%。肝卵圆细胞和造血干细胞表达相同的标记这一事实进一步支持了肝卵圆细胞可能源自骨髓的假说，如Thy1，CD34、Kit。随后，两个独立的小组移植了骨髓细胞，并在富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)缺陷的小鼠肝脏中检测到了供体来源的肝结节。然而，随后证明源自移植骨髓细胞的FAH 阳性的肝细胞是细胞融合的结果，而不是骨髓细胞实际分化为肝卵圆细胞或肝细胞的结果[13]。为了解决这一差异，两个独立的研究小组分别移植了表达GFP 的骨髓细胞或lacZ 转基因骨髓细胞，并证明当受体小鼠遭受了CCl4，ANIT，DDC 或CDE 饮食介导的肝损伤，受体小鼠骨髓细胞在肝再生中的作用微不足道。同时也证明了骨髓细胞大鼠的肝卵圆细胞和肝细胞没有帮助。2007 年，Piscaglia 等的研究证实，粒细胞集落刺激因子可以通过促进骨髓来源的前体细胞迁移至肝脏从而参与肝组织的修复过程，并且粒细胞集落刺激因子能够促进肝卵圆细胞的激活和增殖[14]。但同时也有研究表明，骨髓来源的细胞可以迁移到肝脏，但并未分化为肝胆管细胞，肝细胞，肝卵圆细胞，也并未表达肝组织相关的抗原。由此可见，虽然骨髓来源的细胞在肝脏再生修复过程中发挥重要作用，但并未通过未分化的肝卵圆细胞发挥作用[15]。

1.4 来源于肝星状细胞

肝星状细胞是一种可分泌细胞外基质的肝脏细胞，具有重要的生物功能。其静息状态时储存有大量的类维生素A，存在于肝窦内皮细胞和肝细胞之间Disse 间隙内，Disse 间隙具有干细胞小体的特点，激活后可分化为肌成纤维细胞，金额热导致肝纤维化的发生[16]。目前也有研究发现，它具有向间充质干细胞的特征，体外培养过程中某一时段表达的基因与肝卵圆细胞类似，可以分化为成熟的肝细胞[17]。但是与此同时，也有研究发现，在肝损伤的小鼠的肝组织中，肝星状细胞并不能分化为上皮细胞。因此，关于肝卵圆细胞是否来源于肝星状细胞，还需要进一步的研究。

最近的报告提出将肝星状细胞作为一种肝卵圆细胞。这项研究是基于使用星形胶质细胞标记神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)通过Cre-loxP 技术进行遗传谱系追踪。当给小鼠喂食MCDE 饮食时，Gfap-Cre 标记的细胞有助于肝卵圆细胞区室[18]。而使用的Gfap-Cre 驱动程序不仅在肝星状细胞中活跃，而且在胆管细胞的一部分中也活跃。因此，作者无法排除在小鼠中观察到的兼性HOC 由胆管细胞产生的可能性。实际上，Scholten 等人的后续研究表明星状细胞不会对肝卵圆细胞区域起作用[19]。鉴于星状细胞与肝细胞和胆汁细胞(分别来自中胚层和内胚层)来自不同的胚芽层，因此星状细胞进入肝卵圆细胞可能需要太大的基因表达程序变化才能自然发生。

1.5 成熟的肝细胞

最近，Yanger 和Stanger[3]提出，肝细胞可以经历重编程为胆道谱系。他们将AAV8-TBG-Cre 注射到RosaYFP 小鼠体内，以在成年肝脏中沿追踪完全分化的肝细胞经过DDC 处理后，出现了同时表达胆汁制造者A6 和肝细胞标志物HNF4α的细胞。这些A6+HNF4α+细胞中有41%是双核的，对YFP 的染色进一步证实了这些细胞起源于肝细胞。他们鉴定出大量获得胆道形态并表达OPN，A6，Sox9 或CK19 的YFP+细胞。他们还确定了在DDC 喂养的小鼠肝脏中的双核HOC，但在对照小鼠的肝脏中没有。这些结果表明，肝脏损伤时，肝细胞可以分化为胆管细胞和/或HOC。

2 肝卵圆细胞标志物

肝卵圆细胞的标志物在对其功能研究中具有重要意义。肝卵圆细胞处于胆管上皮细胞和肝细胞之间相互转化过程的各个不同阶段，但是肝卵圆细胞在损伤修复过程中的位置，表型及存在形式都饱受争议。目前有研究试图通过细胞表面标志物对肝卵圆细胞进行筛选区分，但尚未找到统一的表面标志物，同时在研究中证实肝卵圆细胞并非来源于已分化成熟的肝细胞[20]。

肝脏的再生过程很复杂，是一个包括多种细胞增殖，由多条通路、多种因素共同参与的一种复杂而又精确的调控过程，随着分子生物学技术的突飞猛进，近年来随着对肝卵圆细胞研究的不断深入，已经确立了一些肝卵圆细胞高度表达的分子标志物。依据其表达于细胞部位的不同，将其分为3 类：细胞膜类、细胞胞质类、细胞胞核类。

(1)CD 分子类：CD 分子为细胞分化分子，在细胞分化增殖迁移中发挥重要的作用.在肝卵圆细胞增殖模型中，研究发现大量增殖的肝卵圆细胞表面表达多种CD 分子：CD24、CD44、CD90、CD133.CD24 是一种高度糖基化蛋白质分子，与细胞黏附有关，CD24的表达参与了细胞的迁移，并调节细胞生长增殖[21]。

(2)受体类：在构建大鼠肝损伤模型后，通过实验观察可发现，在肝脏再生修复的过程中，增殖的肝卵圆细胞可以表达多种受体，如：CTGF 受体、HGF 受体、SCF 受体、IFN 受体等。这些受体对肝卵圆细胞的增殖，分化起着重要的作用。

(3)大量增殖的肝卵圆细胞还表达分子：OV-1，间质细胞分子标志物：波形蛋白、内皮蛋白、成骨蛋白7；Dorr el l 等应用DDC( 1，4 二氢 3，5 吡啶二甲酸二乙酯)诱导的肝卵圆细胞增殖的模型中，发现大量增殖的肝卵圆细胞表达分子OC2-1 C6，OC2.2A6，OC2.6E10，同时，表达胆管上皮细胞分子标志物：MIC1.1 C3，OC2.1 D11，OC2.2F3；这些在肝卵圆细胞的细胞质中表达的多类型细胞标志蛋白，为肝卵圆细胞多向性分化提供依据[22]。

尽管肝卵圆细胞表面标志物很多，但是要寻找一个相对稳定并且特异的肝卵圆细胞标志物还具有一定的困难，需要我们进一步的探索。

3 肝卵圆细胞与肝再生

在人类以及啮齿动物的各种疾病中都发现了的HOC 的扩增。但是，虽未得到证实，但HOC 对恢复肝实质结构和肝功能的贡献已被假定[23]。到目前为止，已经证明HOC 形成了管腔典型和非典型导管[24]，但尚不清楚这些导管是否功能齐全。虽然在培养细胞中形成管状结构已被用作HOC 分化为胆管细胞的能力的指标[8]，但该测定法并未提供确定的证据支持HOC 衍生的胆管细胞已完全整合到胆道树中。现在仍缺乏支持内源性HOC 在体内形成功能性导管这一假说的确凿证据。

直到最近，HOC 对肝细胞的贡献也引起了争论。使用Foxl1-Cre 进行遗传谱系追踪；RosaLacZ 小鼠证明BDL 后2周，β-gal+/HNF4α+细胞的数量显着增加，表明Foxl1-Cre 标记的HOC 可以形成新的肝细胞[25]。此外，在多种疾病模型(例如PH，DDC，BDL 和CCl4)中采用了腺相关病毒载体AAV8-Ttr-Cre 结合RosaYFP 小鼠进行肝细胞命运追踪[26]。作者发现了来自祖细胞的新形成的肝细胞细胞，尽管贡献有限。同样，另一组报道了2-AAF/PH 大鼠模型中存在稀有的CK19+或GSTP+ CK19-中间肝细胞[27]。在人类中，表达CK7 或也已经观察到CK19[28]。Sackett，Gao 等人证明了BDL 后Foxl1-/-小鼠的导管反应受损与肝再生受损之间的相关性。在BDL 后14天，Foxl1-/-肝脏中CK19 +导管区域的扩张减少，而对照肝脏则CK19+导管区域逐渐增加。与对照小鼠相比，Foxl1-/-小鼠中这种作用与血清AST 水平升高，肝细胞增殖延迟和实质坏死增加有关。这些结果强烈支持HOC 有助于肝脏再生的观点[25]。同样，高濑等证明，DDC 诱导的损伤后，成纤维细胞生长因子7(FGF7)的强制表达导致HOC 反应增强，同时肝损伤和死亡率降低。在HPC 反应期间肝脏中诱导产生的FGF7 可刺激HOC的增殖[23]。

与对照小鼠相比，Fg f7 转基因小鼠中A6+ CK19+ 肝卵圆细胞周围新形成的A6+ CK19-肝细胞急剧增加。他们证明Fgf7 缺陷型小鼠的HOC 降低DDC 治疗后血管扩张，死亡和肝损伤更高[23]。在HOC 激活过程中ECM 沉积会阻止子代向薄壁组织扩展和迁移。当小鼠先接受CDE 饮食3 周，然后再进行2 周减脂饮食时，与仅接受CDE 饮食的小鼠相比，iCreERT2 +HPC 显着增加，这表明HOC 可能在恢复阶段而不是疾病发展过程中发挥作用[29]。总而言之，HOC 会在损伤后促进肝实质增生，尽管在测试的实验模型中这样做的贡献可能很小，但扩增的HOC 仍可能是治疗肝病的目标。

4 肝卵圆细胞的临床应用以及可能存在的问题

目前，对于治疗终末期的肝脏疾病最有效的方法就是进行肝移植。但是不是所有人都能承受高昂的费用以及肝移植后的副作用，而HOC 用于细胞治疗是器官移植治疗肝病的一种有吸引力的替代方法。首先，单个HOC 可以在培养物中扩增而不会失去其双向分化潜能[7]。其次，很多肝脏疾病中发现了HOC，表明HOC 可以是从患病肝脏中分离的。第三，有可能从患有肝病的患者中分离HOC，在培养中进行扩增，然后再移植回患者。这种自体移植方案将消除移植后的免疫抑制。最后，HOC 比肝细胞小，并且有人建议较小的细胞从门静脉注射后较少出现门脉高压[30]。但与此同时，肝卵圆细胞应用于临床也可能存在诸多问题。(1)肝卵圆细胞的分离与纯化目前仅仅在动物模型上得到了进展，尚未在人体上进行。卵原细胞在人体中仅存在于肝脏和骨髓中，在人体中进行肝卵圆细胞的分离与纯化上有一定的风险，目前，如何在人体中能够安全有效的分离出卵原细胞以及如何调控肝卵圆细胞是目前研究的一个难点。(2)对于人体肝卵圆细胞的分离纯化的操作还不太成熟，还需要慢慢摸索，同时对于肝卵圆细胞在人体中促进肝脏再生的信号转导以及传导通路还需进一步研究。(3)尽管有研究表明，肝卵圆细胞移植对于治疗终末期的肝脏疾病有作用，应用前景很光明，但是在应用于临床之前仍有很多的难题等待我们去解决[31]。

5 结论

肝卵圆细胞对于治疗终末期肝脏疾病有很大的应用前景，可以作为代替肝移植进行肝脏疾病的治疗的一种新型治疗手段。但是，还需要进行进一步研究来论证来自不同研究小组的不同结果，以期未来可以应用于临床。