Nrf2及其信号通路在肝缺血再灌注损伤中作用的研究进展

李日，付冉，余伟明，温军业，赵世丛，李越昌，张万星

1 华北理工大学研究生学院，河北唐山063000；2 河北医科大学研究生学院；3 河北省人民医院；4 河北北方学院研究生学院

肝缺血再灌注损伤（IRI）是肝移植、肝切除、低血容量性休克和创伤过程中最常见的组织损伤类型，它的发生是一个复杂、多因素的过程，涉及了多种细胞损伤机制。其中，缺血期出现的组织缺氧、营养物质缺乏、代谢反应中断等因素可损害线粒体活性，而线粒体功能障碍可诱导活性氧（ROS）大量产生，导致肝细胞损伤［1］，再灌注期则可使得炎症介质、凋亡介质以及ROS 等介质被激活，造成组织功能的恶化［2］。肝IRI 的防治策略主要包括缺血预处理、药物预处理及缺血后处理等，但其效果并不突出。在参与减轻肝脏IRI 的转录因子中，核因子红细胞2 相关因子2（Nrf2）是细胞内抗氧化过程的重要调节因子［3］，Nrf2 的激活可诱导产生一系列活性酶，使其具有明显的抗炎、抗凋亡和抗氧化应激等细胞保护作用。近年，越来越多的研究证实Nrf2 对肝脏IRI 有保护作用［4］，且有关其对肝脏IRI 的作用及机制方面的研究也取得了一些成绩。现就肝IRI 中Nrf2相关的信号通路及其作用的研究进展作以下综述，以期为肝IRI的治疗提供新的治疗靶点及策略。

1 Nrf2的结构

Nrf2 起初克隆自人类白血病细胞株，并被鉴定为Cap-n-collar 碱性亮氨酸拉链转录因子家族的成员，是具有神经保护作用的关键转录因子，其含有一高度保守的碱性亮氨酸拉链（bZIP）结构，除此之外，Nrf2 还有6 个高度保守的环氧丙氯相关蛋白同源结构域（Neh），包括Neh1～Neh6。其中，Neh1 区的C端bZIP 结构在Nrf2 与抗氧化反应元件（ARE）的识别与结合中发挥着重要作用，并可启动目标基因的转录；Neh2 区位于结构的氨基端，其包含的DLG 和ETGE 两个基元可作为Nrf2 与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（KEAP1）的结合位点，对Nrf2 的活性起到负性调节作用，与KEAP1 的结合使得Nrf2 被锚定于胞质中而处于失活状态；Neh3 区位于结构的羧基端，可与辅助因子结合活化转录，Neh4 和Neh5 同样可对Nrf2 的转录起到活化作用，当Nrf2 转移入核后可以Nrf2-Maf 二聚体的形式与ARE 结合，在共激活因子cAMP 反应元件结合蛋白的共同作用下启动转录，Neh6 区对转录起负性调节作用，主要负责Nrf2的降解［5-6］。

2 Nrf2在肝IRI中的作用

2.1 抑制氧化应激 氧化应激时，由于机体受外界刺激，体内ROS 大量产生，ROS 则可诱导肝细胞脂质过氧化损伤、蛋白质氧化、线粒体功能障碍和DNA 损伤，在缺血再灌注诱导的肝损伤中起关键作用［2］。Nrf2 进入细胞核后可与ARE 结合进而调节II相代谢酶和抗氧化酶基因表达，如血红素氧合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、醌氧化还原酶-1（NQO1）及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）等来对抗氧化应激。此外，肝细胞激活Nrf2 可导致NADPH 升高，从而防止肝脏氧化损伤。有研究表明，Nrf2通路激活剂（dh404）预处理可显著增加谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）和谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）的表达，并可适度减少肝细胞损伤［7］。15-脱氧-Δ12，14-前列腺素J2（15d-PGJ2）是过氧化物酶体增殖物激活受体γ 的天然配体之一，15d-PGJ2 对肝IRI 小鼠的预处理可诱导Nrf2 的核易位并激活Nrf2，诱导谷胱甘肽S-转移酶M1、NQO1 和GCLC 的表达，以Nrf2 依赖的方式保护肝脏免受IRI 损伤［7］。除此之外，CHEN 等［8］发现，当富马酸和姜黄素联合应用时可显著诱导Nrf2 的表达，提高肝脏三羧酸循环水平，有效介导HO-1 等抗氧化酶的表达，从而抑制肝IRI模型的氧化应激水平。

2.2 抑制炎症 炎症反应在肝脏IRI 的发生中起着重要作用，中性粒细胞、CD4+T 淋巴细胞等炎性细胞的聚集和活化可导致肝细胞、肝窦内皮细胞的损伤；肿瘤坏死因子α（TNF-α）等体液因子则可促进中性粒细胞的聚集和活化，造成肝细胞损伤［9］。近年越来越多的证据表明，Nrf2 可通过抑制炎症反应而减 轻 肝 脏IRI。MASUDA 等［7］选 用Nrf2 激 动 剂（dh404）对肝IRI 大鼠进行预处理，发现激动剂处理组大鼠的肝脏中性粒细胞浸润及髓过氧化物酶活性均显著低于对照模型组，且肝脏的病理学损伤有明显的改善，提示Nrf2 的激活可抑制肝IRI 中的炎症反应进而减轻肝脏损伤。TAO 等［10］研究发现，蔷薇果总黄酮可改善肝脏IRI，其可通过激活Nrf2信号通路而抑制炎症因子白介素-1β、白介素-6和TNF-α的表达，提示Nrf2 可通过抑制炎症反应而减轻肝脏IRI。

2.3 抑制细胞凋亡 细胞凋亡是指细胞结构和功能的不可逆丧失，随着对细胞凋亡研究的进一步深入，我们发现细胞凋亡在肝IRI 进程中发挥着重要作用。辅酶Q10 是一种强抗氧化剂，当辅酶Q10 作用于肝IRI 模型大鼠时，不仅可通过明显活化Nrf2来降低Bax、PUMA 等促凋亡基因的表达，还可明显上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，进而减少肝细胞的凋亡，改善由IRI 引起的肝脏组织病理学损伤［11］。黄芩甙是一种黄酮类化合物，具有较好的生物活性，WU 等［12］将黄芩苷暴露于缺氧/富氧（H/R）诱导的肝细胞来模拟黄芩苷对肝IRI 的影响，发现黄芩苷可通过调节KEAP1-Nrf2-ARE 信号传导通路保护肝细胞免受H/R 诱导的氧化损伤，黄芩苷可显著上调Bcl-2 的表达并下调Bax 表达，减少H/R 刺激的肝细胞凋亡。

3 Nrf2相关通路在肝IRI中的作用

在肝IRI 中起作用的Nrf2 相关通路主要有KE‑AP-Nrf2-ARE 通路、δ-阿片受体（DOR）-蛋白激酶C（PKC）-Nrf2 通路、沉默交配型信息调节2 同源基因1（Sirt1）-Nrf2 信号通路、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K-AKT）-Nrf2 通路、JAK 激酶（JAK）-信号转导子和转录激活子（STAT）-Nrf2 通路、Brahma 相关基因1（Brg1）-Nrf2通路等。

3.1 KEAP-Nrf2-ARE 通路 KEAP1 含有5 个 结构域，其双甘氨酸重复区是KEAP1 与Nrf2 的Neh2 的部位结合区。在正常条件下，Nrf2 位于与其抑制因子KEAP1相连的细胞质中，KEAP1通过泛素化和蛋白酶体降解而抑制Nrf2 的转录活性［13］；应激条件下Nrf2 可与KEAP1 解离，导致Nrf2 进入细胞核，并与ARE 结合启动调节II 相代谢酶和抗氧化酶基因表达，如HO-1、SOD、GPx、NQO1 及γ-GCS 等［14］。越来越多的研究证实，KEAP-Nrf2-ARE 转录通路在体内外对IRI 的保护中发挥重要作用。CHEN 等［15］用SD大鼠构建了肝IRI 模型，结果发现与假手术组相比，肝IRI 组Nrf2、ARE、HO-1、NQO-1 等蛋白表达水平明显增高，而与IRI 组相比，罗格列酮干预组Nrf2、ARE 等蛋白表达水平进一步升高，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶的表达水平明显降低，肝组织病理损伤明显好转，充分印证了Nrf2/ARE 通路在肝IRI 中的保护作用。与之类似，常见抗氧化剂萝卜硫素、西格列汀、西洛他唑等药物也可通过激活Nrf2-ARE 信号通路来改善氧化应激、减弱肝IRI［16-18］。黄芩苷是一种黄酮类化合物，被报道为Nrf2 信号的增强子。有研究表明，黄芩苷处理可显著降低KEAP1 的表达，增加Nrf2 的表达，诱导HO-1和NQO1 的mRNA 表 达，进 而减 轻 肝IRI［19］。LEE等［20］则通过构建直接激活Nrf2-ARE 通路的转基因模型证明了Nrf2-ARE通路过度激活对肝IRI的保护作用。

3.2 DOR-PKC-Nrf2 通路 PKC 是G 蛋白偶联受体系统中的效应物，其在细胞质中可以激活三磷酸腺苷敏感的钾离子通道，从而促进钾离子经线粒体途径流出，抑制钙离子流动，缩短动作电位持续时间以及减少ATP 的消耗，提供器官保护作用［2］。有证据表明，活化的PKC 可调节Nrf2 Ser40 位点的磷酸化，进而促进Nrf2 的转位［21］。DOR 是一种G 蛋白偶联受体，在常氧状态下，DOR 可通过激活PKC 依赖途径进而上调与抗氧化作用相关的Nrf2 靶向基因的表达。在缺血条件下，激活DOR 可降低KEAP1 mRNA 的表达，从而增加Nrf2在细胞质中的释放，增强Nrf2 在细胞核中的功能［22］。有研究表明，［DAla2，D-Leu5］-脑啡肽可激活DOR-PKC-Nrf2 轴，促进Nrf2 核易位和下游Ⅱ期代谢酶和抗氧化基因的表达，显著降低血清中ALT 和AST 及肝匀浆中丙二醛的水平，升高肝匀浆中谷胱甘肽、过氧化氢酶和SOD 水平，被认为是预防肝IRI 的一个潜在靶点［2］。CAO 等［22］则通过体外研究证实，DOR-PKC- Nrf2 通路的信号转导对缺氧—复氧肝细胞损伤的保护作用。以上研究提示在肝缺血再灌注时，Nrf2 可能被通过DOR-PKC信号通路激活。

3.3 Sirt1-Nrf2 信号通路 Sirt1 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的Ⅲ类核组蛋白去乙酰化酶［23］。Sirt1 是去乙酰化酶家族最重要的成员之一，可参与基因表达、代谢和氧化应激等多种生理功能的调节［24］。当Sirt1 触发Nrf2 和KEPA1 的分离时，Nrf2 转位进入细胞核，Sirt1-Nrf2 信号可以激活某些抗氧化酶，改善细胞氧化还原状态。此外，Sirt1 在调节炎症反应中发挥重要作用。Sirt1 基因可通过抑制核转录因子κB 的活动，增加抗氧化基因表达，抑制炎症［25］。辅酶Q10 是线粒体电子传递链的组成部分，MAH 等［26］发现，辅酶Q10 可通过显著激活Nrf2 蛋白恢复氧化与抗氧化平衡，同时可上调Sirt1 和FOXO-3 基因的表达，通过Sirt1-FOXO-3-Nrf2 信号通路显著改善了IRI 损伤引起的肝脏功能障碍和氧化应激，并且改善了IRI 引起的组织病理学损伤。有研究表明，金樱子总黄酮（TFs）预处理可增加肝脏组织中Sirt1、总Nrf2、核Nrf2、HO-1、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的水平，降低细胞质Nrf2 的水平，表明TFs的抗IRI 作用可能是通过激活Sirt1-Nrf2-ARE 通路提高HO-1和GST蛋白水平，改善氧化应激进而减少肝细胞损伤［23］。证明Sirt1 可以激活Nrf2-ARE 信号通路来减轻肝IRI。

3.4 PI3K-AKT-Nrf2 通路 PI3K-AKT 轴是一种细胞存活通路，在调节细胞增殖和细胞凋亡中发挥重要作用。PI3K-AKT 信号级联通过抑制促炎细胞因子的产生和凋亡，对IRI 具有很强的保护作用［27］。一旦PI3K 被激活，它可将磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸转化为磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸，进而磷酸化并激活AKT［28］。AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对细胞内外多种细胞刺激均有反应，是生存信号的重要调控因子。激活的AKT 可促进下游分子的磷酸化，包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和Bcl-2，以抑制细胞凋亡［29］。除此之外，PI3K-AKT的级联反应对Nrf2 的激活具有正向影响。越来越多的证据表明，PI3K-AKT 信号通路对IRI 具有很强的保护作用。CARINI 等［30］发现，缺氧预处理后的肝细胞可激活PI3K 并调节蛋白激酶C 依赖的信号通路，提示PI3K在肝细胞耐缺氧中起重要作用。碲酸可诱导PI3K和AKT 蛋白表达明显上调，并可恢复IRI 的组织病理学变化，通过激活Nrf2 和PI3K/AKT 信号级联，为肝IRI提供一种新的治疗方向［14］。

3.5 JAK1-STAT-3-Nrf2 通路 JAK-STAT 信号通路是细胞因子信号转导的主要通路之一，除了可以调节细胞增殖和凋亡外，还可以调节炎症反应，在肝IRI 中发挥重要作用［31］。STAT-3 的表达异常不仅在脑、心、肾等多种器官的IR 损伤中起重要作用［32］，XIONG 等［33-34］研究发现，在肝脏IRI 过程中，STAT-3表达和功能也显著增强，进而证实了STAT-3与肝脏IR 也密切相关。KAMEL 等［29］用血管紧张素转换酶抑制剂培哚普利对肝IRI 大鼠进行预处理，发现培哚普利可显著降低JAK1/STAT-3 蛋白表达，可通过激活JAK1-STAT-3-Nrf2 信号通路，改善肝IRI 期间的氧化应激和炎症反应，并明显减少肝脏损伤。

3.6 Brg1-Nrf2 通路 Brahma 相关基因1（Brg1）是SWI/SNF 复合体的核心ATP 酶，是染色质重构复合物的一个亚基，在哺乳动物细胞基因的激活和转录中起着核心作用，且在不同组织中干细胞的增殖、分化中发挥重要作用［35］。Brg1 可保护抗氧化防御基因启动子免受氧化损伤。有研究证明，肝IRI 可显著增加氧化损伤，降低Brg1 的表达［36］。GE 等［35］用Brg1 过表达的转基因小鼠对其进行肝IRI 处理，发现IRI 早期Brg1 的表达被抑制，但再灌注时有所恢复，Brg1 在再灌注时的恢复可以增强Nrf2 介导的HO-1 的表达，从而有效提高抗氧化能力，对抗肝细胞损伤；在转基因小鼠中，Brg1 的过表达可显著降低肝IRI 的氧化应激，同时该学者通过构建缺氧/复氧细胞模型，从体外研究来验证Brg1 在肝IRI 中的作用；在Brg1 基因转染的细胞中，Brg1 的过表达减弱了肝IRI 的氧化应激水平，同时Nrf2 蛋白表达增强，HO-1 诱导及启动子荧光素酶活性增强，而在Brg1 基因敲除细胞中，上述现象均不存在。一项关于Brg1 是否能减轻肝脏缺血再灌注所致肺损伤的研究表明，Brg1 的过表达可增加Nrf2 的表达和核转位，并可激活抗氧化酶、降低炎症因子的表达，从而减轻肝脏缺血再灌注诱导的肺氧化损伤［36］。

综上所述，在肝缺血再灌注时，Nrf2 可通过抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡等作用来减轻肝脏IRI。Nrf2 相关信号通路主要有KEAP-Nrf2-ARE 通路、DOR-PKC-Nrf2 通 路、Sirt1-Nrf2 信 号 通 路、PI3KAKT -Nrf2 通路、JAK-STAT-Nrf2 通路、Brg1-Nrf2 通路等，以上通路并非独立，往往几种信号通路相互交联，共同参与抑制肝IRI。越来越多的证据表明，Nrf2 对各种肝脏疾病具有保护作用，如胆汁淤滞性肝损伤、病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝损伤、肝IRI 和原发性肝脏恶性肿瘤等，越来越多的中医药也已被证实可通过Nrf2 改善肝IRI，然而，其激活Nrf2 的途径减轻肝IRI 的具体机制尚待进一步研究。通过激活Nrf2 来减轻肝IRI 可能是一种新的治疗缺血性肝病的策略，其激活的作用机制及其作用底物尚有待进一步研究，以Nrf2 为作用靶点开发的药物对于治疗肝IRI 具有临床指导意义，有望为临床治疗肝IRI寻找新的方案提供机遇。