溃疡性结肠炎的关键致病基因及治疗中药活性成分筛选

刘涛，陈新怡，朱晓彤，杨焘，陈小娟，仇婧玥，刘恒铭，冯瑶，宋厚盼 湖南中医药大学中医学院，长沙 4008；湖南中医药大学医学院

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种可发生在结、直肠任何部位的慢性、弥漫性非特异性炎症性病变。UC最常见于直肠和乙状结肠，少数可累及回肠末端。UC的主要病理特征为结肠黏膜的炎症反应，多局限于黏膜层和黏膜下层，肠壁无明显增厚，主要表现为黏膜的大片水肿、充血、糜烂和溃疡形成。临床上最常见的UC症状为血性腹泻，多为脓血便，常伴有痉挛性腹痛，少数严重患者因直肠受累而有里急后重感。截至目前，UC的病因病机尚不明确，可能与遗传、环境、微生物等因素和肠道免疫系统有关。UC发病的病理反应可见炎性介质释放、氧化应激、肠道微环境紊乱、肠道通透性增加等［1］。5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂是现代医学治疗UC的主要药物，临床实践发现部分患者疗效欠佳，且长期使用可产生严重不良反应［2］。因此，寻找与UC发病密切相关的基因对明确UC的发病机制及探索潜在的防治UC药物具有重要意义。随着人类基因组计划的完成，以高通量测序/芯片分析为主的组学技术及生物信息学分析技术逐渐兴起，为研究复杂疾病的病理机制提供了重要的技术支持［3］。本研究采用生物信息学方法，通过提取NCBI（National Center for Biotechnology）基因表达综合数据库GEO（https//：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中与UC发生发展密切相关的基因芯片数据，并对正常人和UC患者的结肠黏膜差异表达基因进行分析，旨在阐明与UC发病紧密相关的信号通路以及关键基因靶点，挖掘潜在的可用于治疗UC的中药活性成分。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 数据来源 在GEO数据库中下载UC患者和正常人的结肠黏膜组织转录组数据。本研究所采用的UC相关基因芯片数据集为GSE87466，该数据集基于GPL13158平台［4］，采用［HT_HG-U133_Plus_PM］Affymetrix HT HG-U133+PM Array Plate阵列芯片检测获得。最终纳入87例UC患者结肠黏膜组织标本（包括27例广泛性UC样本和60例局限性UC样本）和21例健康成人结肠黏膜组织标本。纳入着年龄＞18岁。本研究经湖南中医药大学中医学院伦理委员会批准同意。

1.2 UC患者及正常成人结肠黏膜组织显著性差异表达基因（DEGs）筛选

1.2.1 芯片数据质量评估 收集21例健康成人肠黏膜组织和27例广泛性UC患者肠黏膜组织标本的数据。下载成人UC基因芯片GSE87466的CEL探针文件及数据包。运用R-Project（www.r-project.org）Bioconductor 3.5.0软件的affyPLM数据包对芯片数据进行质量控制，对数据进行背景校正和log2转化，运用RMA算法对原始数据进行标准化处理，通过绘制小提琴图对处理后的数据进行质量评估。将GSE87466芯片数据的质量评估与均一性结果绘制成小提琴图，横坐标为48个样本编号，纵坐标为芯片数据相对对数表达值（Relative Log Expression，RLE），小提琴的中心白色点表示RLE值中位数，小提琴顶端和底端分别表示RLE值四分位点。所有小提琴的中心白色点基本位于一条直线上，48个样本的RLE平均值均在5.7～5.8之间，提示数据均一性良好，该芯片数据可用于后续分析。

1.2.2 UC患者及正常成人结肠黏膜组织DEGs筛选 通过R软件limma数据包筛选出P＜0.05且|log-FC（fold-change）|＞2的基因为差异表达基因探针，把探针转化为标准基因名。通过分析logFC，（“FC”表示UC病例组受试芯片荧光信号强度与对照组相比的差异倍数）［5］、P值、基因符号（gene symbol）等得到UC患者较正常组的上调和下调表达基因，采用GraphPad Prism 5在线软件（https：//www.graphpad.com/scientific-software/prism）绘制DEGs火山图，获得上调、下调表达基因的整体分布趋势。以P＜0.01且|logFC|＞2为筛选条件获UC患者及正常成人结肠黏膜组织差异表达基因，并对DEGs进行层次聚类分析，绘制聚类热图。以Log2（Fold change）的绝对值≥1及-Log10（Pvalue）值＞2为条件进行筛选并绘图，一个点代表一个基因，红色点代表基因表达上调，绿色点代表基因表达下调，黑色小方块表示基因没有显著差异变化；横坐标为纳入样本，纵坐标为具体的差异表达基因名称，上部树状结构表示样本间显著性差异基因表达谱的分类模式，左侧树状结构表示样本间DEGs表达值的聚集模式。

1.3 UC患者及正常成人结肠黏膜组织差异表达基因基因本体（Gene Ontology，GO）和信号通路富集分析 GO分析［6］主要涵盖注释基因及其表达产物分析，包括细胞组成（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）。KEGG是系统分析基因功能和酶途径，并将基因组信息与高阶功能信息连接起来的知识库［7］。DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）是一个集基因注释、可视化和综合挖掘功能的数据平台，它包含一套全面的功能注释工具，可用于理解差异表达基因的生物学意义［8］。我们采用DAVID 6.8生物信息资源数据库对所获得的差异表达基因进行GO和KEGG分析。将P＜0.05和FDR（False Discovery Rate）＜0.05设为显著性基因富集临界，选取20条显著富集的信号通路。

1.4 UC患者及正常成人结肠黏膜组织DEGs蛋白互作网络分析和关键靶点筛选 采用String在线分析数据库（http：//string-db.org）探索差异表达蛋白质间的相互作用、信号通路间的交互作用、靶点之间的调控关系。将“1.4”中差异表达基因导入String进行蛋白质互作网络（protein-protein interaction，PPI）分析，设置可信度（Confidence）为0.7，得到差异表达基因的PPI。在PPI网络图中，节点表示基因或信号通路，边线表示基因或通路之间的相互作用关系。节点的大小用“度”值表示，该值越大，节点面积越大，颜色越深，位置越靠近网络中心。采用Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）直观描述生物分子间相互作用关系，其中节点表示基因、分子或蛋白质，连线表示生物分子之间的相互作用。通过其插件“cytoHubba”筛出UC患者及正常成人结肠黏膜组织差异表达基因网络中的核心基因。将获得的蛋白相互作用数据导入cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析，分别采用Degree、Closeness、EPC算法，筛选得分排名前10的基因，再取交集获得3种算法中均存在的基因，即为UC患者和正常人结肠黏膜关键DEGs。

1.5 靶向治疗UC的相关中药成分筛选 采用比较毒理基因组学数据库（CTD，http：//ctdbase.org/）中有关化学物质和基因产物之间相互作用及其与疾病关系的信息和数据，进行基因跨物种比较研究，提供手动策划的化学成分-基因、化学成分-疾病和基因-疾病相互作用、彼此集成以及与选定的外部数据集集成资料，以生成扩展的网络并预测新的关联数据。将“1.4”中分析的核心基因导入CTD中，获取与核心基因有相互作用的化学物质，以交互作用值＞1为筛选条件对涉及的中药活性成分（药物）进行分析。

2 结果

2.1 UC患者的核心致病基因

2.1.1 UC患者及正常成人结肠黏膜组织差异表达基因分析结果 UC患者及正常成人结肠黏膜组织差异表达基因54 716个。其中表达上调基因2 756个（5.04%，2 756/54 716）、表达下调基因12 844个（23.47%，12 844/54 716）。

以P＜0.01，|logFC|＞2为条件，最终筛选UC患者及正常成人结肠黏膜组织显著性差异表达基因279个。与正常成人结肠黏膜比较，UC患者结肠黏膜组织中表达显著上调基因177个、表达显著下调基因102个。

2.1.2 UC患者及正常成人结肠黏膜组织DEGs GO功能分析结果 显著差异表达基因主要涉及炎症反应、趋化性、免疫反应、趋化因子介导信号通路、中性粒细胞趋化性、对脂多糖的反应、胶原蛋白分解代谢过程、细胞间信号、先天免疫反应、细胞趋化作用等生物学过程；涉及的分子功能主要包括趋化因子活性、肝素结合、CXCR趋化因子受体结合、金属内肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、CXCR3趋化因子受体结合、运输活性、RAGE受体结合、钙离子结合、水通道活性等；主要富集于细胞外空隙、细胞外区域、蛋白质细胞外基质、质膜、细胞外泌体、细胞外基质、质膜组成部分、基底膜、质膜外侧及顶端质膜等区域。

2.1.3 UC患者及正常成人结肠黏膜组织DEGs KEGG通路富集分析结果 显著差异表达基因主要涉及趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、军团菌病、肿瘤坏死因子信号通路、补体和凝血级联、金黄色葡萄球菌感染、风湿性关节炎、胆汁分泌、百日咳、疟疾、造血细胞谱系、细胞黏附分子（CAMS）、Toll样受体信号通路、利什曼病、沙门氏菌感染、NOD样受体信号通路、花生四烯酸代谢、视黄醇代谢、药物代谢细胞色素P450等。其中最显著的5条信号通路分别为趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用通路、军团菌病、肿瘤坏死因子信号通路、补体和凝血级联；涉及基因数量最多的五条信号通路分别为细胞因子与细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、军团菌病、补体和凝血级联。

2.1.4 UC患者与正常成人结肠黏膜组织DEGs PPI网络及关键靶点分析结果 PPI网络图得到267个节点及1 367个相互作用关系。最终得到白细胞介素-8（CXCL8）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、表皮生长因子（EGF）、白介素1β（IL1B）、趋化因子2（CCL2）、白细胞介素-1（CXCL1）、白细胞介素-10（CXCL10）及白细胞介素2（CXCL2）等8个关键靶点，度值和紧密度最大基因为CXCL8，平均最短路径长度值最大基因为CXCL2。

2.2 靶向治疗UC的中药成分筛选结果 靶向作用于CXCL8用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括白藜芦醇、槲皮素、姜黄素、辣椒素、肉桂醛、丁香酚、金雀异黄素、异丁香酚、棕榈酸等；通过靶向作用于MMP9用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括异甘草素、野百合碱、木犀草素、柚皮苷、紫檀芪等；通过靶向作用于IL1B用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括儿茶素、鱼藤酮、香叶醇、芹菜素、鹿角菜胶、山奈酚、桔梗皂苷D、大蒜素、三七皂苷R1、橙皮素、洋地黄毒苷等；通过作用于EGF用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括没食子酸、柳杉碱、异槲皮素、人参皂苷Rg3等；通过靶向作用于CCL2用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括虎杖苷、桑色素、萝卜硫素、藤黄酚、薯蓣皂素等；通过靶向作用于CXCL1用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括迷迭香酸、雷公藤内酯醇、香芹酚、绿原酸、巴豆油等；通过靶向作用于CXCL10用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括白杨素、新菊粉、紫杉醇等；通过靶向作用于CXCL2用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分包括牛磺胆酸、己基肉桂醛、齐墩果酸、熊去氧胆酸、爬山虎内酯等。

3 讨论

UC为炎症性肠病（IBD）的主要亚型之一，UC可增加结直肠癌的风险，其特征是慢性肠道炎症和由促炎细胞因子和趋化因子介导的白细胞持续流入，病变主要位于结肠黏膜和黏膜下层，临床表现为腹痛、腹泻和黏液脓血便等。UC多见于青壮年发病，其病理机制复杂，涉及遗传、免疫、环境等多种因素［9，20］。5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等现代医学药物治疗本病对部分患者疗效欠佳且可出现严重的不良反应。本文利用基因芯片技术与生物信息学方法，旨在宏观、整体地考察与溃疡性结肠炎发病密切相关的基因，探寻可能用于溃疡性结肠炎防治的中药活性成分，从而为溃疡性结肠炎的临床诊断与治疗提供理论基础。

DEGs分析结果显示，与正常成人结肠黏膜相比，UC患者结肠组织存在明显的差异表达基因279个，其中上调基因177个，下调基因102个。差异倍数最大的为几丁质酶3样蛋白1（CHI3L1），CHI3L1为类几丁质酶，属于哺乳动物几丁质酶基因家族成员［10］，虽然无几丁质酶活性，但可与几丁质或壳聚糖结合。研究［11］表明，分泌的CHI3L1蛋白可参与细胞对不利刺激的保护性反应。CHI3L1在多种急慢性炎症性疾病如溃疡性结肠炎、消化性溃疡中均呈高表达，可作为一种新型炎症标志物［12］。

本研究GO分析结果显示，UC与正常人结肠组织显著性差异表达基因与炎症反应、趋化性、免疫反应、趋化因子介导信号通路、中性粒细胞趋化性等密切相关。该结果与KEGG分析显示的趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、细胞黏附分子（CAMS）、Toll样受体信号通路相对应。这些研究结果亦与其他学者的研究结果相吻合，如有研究显示免疫因素是溃疡性结肠炎发生的重要因素之一。抗炎细胞因子IL-4等使肠道发挥正常免疫功能；促炎细胞因子IL-1、TNF-α等参与细胞免疫反应，激发肠道炎症反应，介导UC发病。Toll样受体信号通路为影响UC发病的核心通路之一。Toll样受体信号参与激活先天免疫和适应性免疫反应，在炎症性疾病中起着关键作用，此信号通路的失调可导致结肠上皮层止血障碍、过度修复反应、慢性炎症以及结直肠癌的发展［13］。结肠炎microRNA表达谱研究［14］显示，Toll样受体通路在结肠炎中与microRNA联系紧密，在调控结肠炎症反应中发挥重要作用。

通过构建UC患者与正常人显著性差异表达基因的PPI网络，运用cytoHubba中Degree、Closeness、EPC 3种算法分别筛选出基因节点中心度排名前10的基因，再运用韦恩图取交集得到3种算法中均存在的8个核心靶点。其中CXCL8、MMP9处于网络核心位置。促炎细胞因子在免疫调节方面发挥重要作用，已被充分证明参与了UC发病过程炎症反应［15］。CXCL8是CXC趋化因子家族的成员，是炎性反应的关键介质。CXCL8是诱导中性粒细胞趋化性和脱粒相关的促炎性趋化因子。CXCL8蛋白由多种细胞类型分泌，包括肠上皮细胞（IEC）。CXCL8 mRNA表达仅限于具有炎症活动和黏膜破坏组织学迹象的区域［16］。在结肠炎和结肠癌中，微环境成纤维细胞表现出一种活化的炎症表型，有助于肿瘤的发生，并伴有趋化因子CXCL8的过度分泌［17］。

MMPs是一类参与细胞外基质降解和重塑的酶。MMPs已被证实在实验性炎症性肠病（IBD）动物模型、肠细胞系以及炎性改变组织培养中均参与炎症过程［18-19］。MMP9是参与IBD发展有关的主要金属蛋白酶。对MMP9缺陷小鼠的研究表明，MMP9可参与IBD发展的早期阶段［18］。虽然MMP9在UC中引发炎症的确切机制尚不清楚，但有研究证明它可参与减少细胞黏附和中性粒细胞对损伤部位的吸引。在细胞系和动物模型的研究中，应用金属蛋白酶抑制剂可减少UC的发生［20］。本文研究发现MMP9和CXCL8都集中在网络中心，且在三中算法中排名前二。此外，上述两个基因之间存在直接和间接的相互作用。因此，本文推测MMP9和CXCL8之间的相互作用在UC的发病机制中发挥了重要作用。

CTD结果显示，白藜芦醇、槲皮素、姜黄素对溃疡性结肠炎作用强烈，研究价值较高。白藜芦醇是一种存在于葡萄和葡萄酒中的多酚类化合物，具有多种药理作用，主要有抗炎、抗氧化、抗癌和免疫调节等。它被认为是预防和治疗慢性炎症和自身免疫性疾病中最有前途的天然分子之一。有研究［21］显示，白藜芦醇是一种有效的、无毒的、互补的、可替代的治疗结肠炎和潜在结肠癌的药物。另有动物实验研究［22］表明，白藜芦醇能明显减轻大鼠体重下降、腹泻、直肠出血等临床症状，改善疾病活动指数和炎症评分。此外，白藜芦醇喂养的溃疡性结肠炎动物可存活并完成治疗，而标准饮食喂养的溃疡性结肠炎动物死亡率为40%。白藜芦醇可下调UC发病过程p38表达，降低前列腺素E合成酶-1（PGES-1）、环氧化酶-2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白的表达，提示白藜芦醇膳食可能是治疗慢性肠道炎症的一种新方法。

槲皮素（3，3'，4'，5-7-五羟基黄酮）是一种与山奈酚有相关性的黄烷醇，通过清除氧自由基、抑制黄嘌呤氧化酶、脂质过氧化和螯合金属离子等多种机制，防止氧化损伤和细胞死亡。黄酮类化合物由于其良好的抗氧化和抗辐射特性，越来越被视为有益的膳食成分。此外，黄酮类化合物还具有多种生物学效应，包括酶（脂氧合酶、环氧化酶、一氧化氮合酶）抑制、免疫细胞调节等。研究表明，槲皮素和其他黄酮类化合物能能显著降低IBD患者和健康人淋巴细胞的体外氧化应激［23］。此外，槲皮素及其衍生物被发现是幽门螺杆菌刺激的中性粒细胞呼吸爆发的抑制剂和非竞争性尿素酶抑制剂，这表明它们可能在治疗幽门螺杆菌诱导的胃溃疡或其他胃肠疾病中具有潜在的应用价值［24-25］。另有相关实验表明，槲皮素对TNBS（三硝基苯磺酸）诱导的结肠炎的保护作用可能与其抗氧化作用有关，提示槲皮素对TNBS诱导的溃疡性结肠炎具有治疗作用。

姜黄素是一种存在于姜黄中的具有较强生物活性的植物化学物质，具有抗炎作用，其药理作用已在溃疡性结肠炎实验模型中被证实。报道表明，姜黄素对缓解溃疡性结肠炎患者的病情有效，是一种安全有效的治疗静止期UC的药物。实验［26］表明，姜黄素联合美沙拉秦治疗轻中度活动期UC的临床效果优于安慰剂和美沙拉秦联合治疗，且无明显不良反应。提示姜黄素可能是一种安全、有前途的治疗UC的药物。

综上，本文通过生物信息学方法深入挖掘溃疡性结肠炎芯片数据，发现了279个显著性差异表达基因及其相关通路，最终结果发现，UC差异基因涉及炎症反应、趋化性、免疫反应、中性粒细胞趋化性、趋化因子活性、CXCR趋化因子受体结合、RAGE受体结合、钙离子结合等多个生物学过程和分子功能，参与了趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路等经典的与炎症和免疫相关的信号通路。CXCL8、MMP9、EGF、IL1B、CCL2、CXCL1、CXCL10及CXCL2异常表达可能在UC发生发展中发挥关键作用。进一步研究发现，白藜芦醇、槲皮素、姜黄素、儿茶素、鱼藤酮、香叶醇、芹菜素等中药活性成分可能是有效的治疗UC的靶向药物。本文研究结果可为探究UC的发病机制及其早期诊断与治疗提供新的思路与方法。