白菜PRX基因家族的鉴定与生物信息学分析

陈国户，王浩，李广，唐小燕，汪承刚，张磊，侯金锋，袁凌云

（安徽农业大学园艺学院，安徽省园艺作物育种工程实验室，合肥230036）

过氧化物酶是一类广泛存在于生物体内的酶，它催化作为电子受体的过氧化氢和多种电子供体之间的氧化还原反应[1-2]。根据其蛋白序列和结构特征，可将过氧化物酶分为非血红素过氧化物酶和血红素过氧化物酶，其中，血红素过氧化物酶主要分为动物类血红素过氧化物酶和非动物类血红素过氧化物酶[3]。根据其氨基酸序列和催化性能，非动物类血红素过氧化物酶又可细分为3 类：Ⅰ类过氧化物酶，属于胞内型，包括酵母细胞色素c 过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶和细菌来源的触酶-过氧化物酶；Ⅱ类过氧化物酶，来源于真菌，为胞外型，包括各种由真菌产生的锰过氧化物酶和木素过氧化物酶[2]；Ⅲ类过氧化物酶（class Ⅲperoxidases, PRX），是植物特异性氧化还原酶，是来源于高等植物的分泌型过氧化物酶，参与植物体内多种不同的生理过程，如植物体内毒性过氧化物的清除、细胞壁的合成、组织的愈伤、生长素的合成与代谢等[2-3]。

陆生植物含有数量较多的PRX，它们通常分泌到液泡和细胞壁中[3]，其蛋白质结构和分子质量在直系同源基因和旁系同源基因中高度保守[1]，通常包含10～12 个保守的α 螺旋和2 个短的β 链[2,4]，主要参与过氧化物循环和羟基化循环，减少过氧化氢的产生和活性氧的形成[3,5]，对生物胁迫和非生物胁迫反应都有一定的作用。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtPrx64过表达可增强转基因烟草植株对铝胁迫的耐受性[6]；AtPRX3（AtRCI3）可正向调节植物对干旱和盐胁迫的耐受性[7]。番茄（Solanum lycopersicum）中PRX可抑制Ep5C的表达，降低由紫丁香假单胞菌侵染引起的细菌斑点敏感性[8]。辣椒（Capsicum annuum）CaPO2 基因沉默植株表现出对黄单胞菌感染的敏感性，而CaPO2在转基因拟南芥中过表达则表现出对细菌的抗病性[9]。萝卜（Raphanus sativus）过氧化物酶基因rsprx1在抑制表达条件下具有抗盐、抗氧化和抗高温功能[10]。总之，PRX 在植物的生物和非生物胁迫反应中具有诸多积极作用。

迄今为止，已经鉴定出了部分植物PRX基因家族成员，其中包括拟南芥的73 个PRX 基因[11]，水稻（Oryza sativa）的138 个PRX 基因[12]，白梨（Pyrus bretschneideri）的94个PRX基因[13]。研究发现，PRX基因在植物生长发育以及响应生物和非生物胁迫方面发挥着积极作用[2]，而对白菜（Brassica rapa）PRX（BrPRX）基因家族的研究目前未见报道。为此，本研究采用生物信息学分析技术对BrPRX基因家族成员进行全基因组鉴定和分析，以期为进一步研究BrPRX功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从白菜基因组数据库（http://brassicadb.org/brad/）[14]中下载白菜基因组序列和注释文件（V1.5），以拟南芥PRX 家族蛋白序列[11]为种子序列，利用Blast 程序对其全基因组进行搜索；筛选的候选序列在SWISS-PROT[15]、SMART[16]、Pfam[17]及InterProScan5[18]等数据库中进行鉴定，获得BrPRX基因家族成员。

从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载白菜不同组织[19]及细胞核雄性不育（genic male sterility,GMS）[20]、细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility, CMS）[21]与ftms 雄性不育突变体[22]的RNA-Seq 数据，质控后与白菜基因组序列进行比对，采用FPKM 计算基因表达量[23]；同时，采用DESeq 或DEGseq 软件包进行差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）分析。

1.2 BrPRX 家族基因的基因组信息及生理生化性质分析

通过获得的BrPRX 基因序列信息，利用TBtools[24]将BrPRX 基因定位到染色体上。采用Compute pI/Mwsoftware 在 线 工 具（https://web.expasy.org/compute_pi/）预测BrPRX 蛋白的分子质量和等电点[25]；利用WoLF PSORT在线工具（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位分析。

1.3 BrPRX 家族基因保守结构域及系统进化树分析

利用MEME 4.12.0软件[26]对BrPRX家族基因的保守基序进行分析，并利用TBtools 绘制保守域和基因结构示意图。对白菜和拟南芥的PRX 蛋白质序列进行ClustalW 比对，使用MEGA 7.0 软件中的邻接法以及泊松校正与成对删除法构建系统进化树。

1.4 BrPRX 基因启动子顺式作用元件分析

从白菜基因组中提取BrPRX 家族基因起始密码子上游2 000 bp 的序列，利用PlantCARE 数据库[27]分析启动子顺式作用（cis-acting）元件；利用GSDS 2.0软件[28]进行可视化。

1.5 BrPRX 基因种内及种间共线性分析

利用all-against-all BlastP 工具，对白菜基因组及其与拟南芥基因组进行比对（E＜1e－5，top 5），利用MCScanX 程序分析共线性及基因复制区块，采用TBtools 软件进行绘图。采用KaKs_Calculator 2.0软件[29]进行基因非同义替换和同义替换分析，摈弃同义替换率（Ks）＞2.0的数值，以避免替代饱和风险，并计算分离时间。

1.6 BrPRX 基因转录组表达分析

根据白菜不同组织的转录组数据[19]，分析BrPRX 家族基因在各组织中的表达情况；根据GMS、CMS及ftms雄性不育突变体材料的转录组数据[20-22]，分析BrPRX 家族基因在雄性不育花蕾中的相对表达情况。

2 结果与分析

2.1 BrPRX 家族基因全基因组鉴定与理化性质分析

根据拟南芥PRX蛋白质序列，对白菜基因组序列进行全基因组BlastP搜索，经筛选鉴定，在白菜基因组中共鉴定出121 个PRX 基因家族成员（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.06.011）。理化性质分析发现，BrPRX 家族基因开放阅读框（open reading frame, ORF）长度为753～1 326 bp，编码250～441 个氨基酸，蛋白质分子质量在27.39～47.67 kDa 之间，其等电点（isoelectric point, pI）在4.40～10.78 之间（附表1）。此外，对BrPRX家族基因进行亚细胞定位预测的结果显示，其定位在细胞核、线粒体、细胞质、液泡、内质网膜、细胞质膜等细胞器上（附表1）。

2.2 BrPRX 家族基因染色体定位分析

从图1 可见，除Bra039816 基因定位于Scaffold000178 上，其 余120 个BrPRX 基 因 在 白 菜10 条染色体上呈不均匀分布，其中：A03 染色体上数量最多（19个），A09和A02染色体上次之，分别为18和17个，A05和A08染色体上最少（6个）。另外，BrPRX 基因家族存在较多的串联重复基因簇，其中在A10染色体上数量最多（3个）。

2.3 BrPRX 家族基因保守基序及外显子-内含子分析

图1 BrPRX家族基因的染色体定位Fig.1 Chromosomal mapping of BrPRX family genes

利用MEME 4.12.0 软件对BrPPX 家族基因保守基序（motif）进行分析，结果（图2）显示：亲缘关系越近的成员其基序结构相似度越高；在内含子和外显子数量上，BrPRX基因间存在较大差异，含有0～9个数量不等的内含子。

图2 BrPRX家族基因保守基序及基因结构分析Fig.2 Conserved motif and gene structure analyses of BrPRX genes

2.4 白菜与拟南芥PRX 家族基因进化分析

利用MEGA 7.0软件对白菜与拟南芥PRX家族基因进行多序列比对并构建进化树，结果（图3）显示，白菜和拟南芥PRX家族基因分成5个簇（group），其中：簇1 的PRX 基因最多，包括25 个AtPRX 基因和45 个BrPRX 基因；簇3 数量最少，仅有7 个，包括5个BrPRX基因和2个AtPRX基因。

2.5 BrPRX 家族基因共线性及非同义替换率（Ka）/同义替换率（Ks）分析

图3 白菜和拟南芥PRX家族基因系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PRX family genes from A.thaliana and B.rapa

利用MCScanX 软件对BrPRX 基因进行共线性分析，结果（图4）显示，121 个BrPRX 家族成员中有65 对存在共线性关系，A01、A02、A03、A09 上的BrPRX 家族成员共线性较多，A05 染色体上BrPRX家族基因共线性较少。为了进一步分析白菜PRX基因家族的系统发育机制，利用拟南芥基因组信息，构建白菜与拟南芥的基因共线性比较图谱，结果（图5）发现，98 个BrPRX 与65 个AtPRX 共组成111个基因对。表明这些PRX基因对可能来自共同的祖先，具有相同的功能。此外，这些基因对中，每个AtPRX基因映射1～3个BrPRX同源基因（附表2，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.06.011），说明白菜在进化过程中存在基因组三倍化复制现象[30]。Ka/Ks分析（附表2）发现，111个基因对的Ka/Ks值均小于0.5，表明这些基因经历了较强的纯化选择，且在进化中较为保守，结构较为稳定，功能具有一致性。

2.6 BrPRX 家族基因启动子顺式作用元件分析

对BrPRX 家族基因的启动子进行顺式作用元件分析，结果（附图1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.06.011）显示，绝大多数的BrPRX家族基因与生长发育、激素调控和抗逆等相关。其中：54个基因含有防御和应激反应元件（TC-rich repeats），65个基因具有赤霉素响应元件（GARE-motif、P-box和TATC-box），66个基因具有生长素响应元件（TGA-element、AuxRR-core、TGA-box 和AuxRE），58 个基因具有水杨酸响应元件（TCA-element），95 个基因具有茉莉酸响应元件（TGACG-motif 和CGTCA-motif），99 个基因具有脱落酸响应元件（ABRE），108个基因具有光响应元件（G-Box和GA-motif）。此外，共有上述元件的有8个基因，可能在响应激素调节、光信号和抵抗逆境过程中起重要作用。

图4 BrPRX家族基因的共线性图谱Fig.4 Synteny map of BrPRX family genes

图5 白菜与拟南芥PRX家族基因的共线性图谱Fig.5 Synteny map of PRX family genes between A.thaliana and B.rapa

2.7 BrPRX 家族基因表达模式分析

利用白菜不同组织转录组数据[22]分析BrPRX家族基因在根、茎、叶、花、角果、愈伤组织等中的表达特征，结果（图6）表明：7个BrPRX基因（Bra005456、Bra005458、Bra036445、Bra033551、Bra031832、Bra008291、Bra020071）未检测到表达量，其余114个基因至少在1个组织中表达，其中有32个基因在各个组织中均有表达；值得注意的是，Bra013576在各组织中具有超高表达量，说明该基因对白菜生长发育具有重要作用。此外，部分BrPRX基因在不同组织中存在特异性表达，其中：Bra004014 与Bra039137在根中特异性表达；Bra024635在花中特异性表达；Bra015695与Bra036842在角果中特异性表达。

图6 BrPRX家族基因在不同组织中的转录组表达分析Fig.6 RNA-Seq analysis of BrPRX genes in different tissues

为进一步分析BrPRX 家族基因在生殖生长阶段的功能，利用GMS、CMS 与ftms 雄性不育突变体的花蕾转录组数据分析其表达量，结果显示：GMS中有7个BrPRX成员上调表达，11个成员下调表达；CMS 中有5 个成员上调表达，12 个成员下调表达；ftms 中有3 个成员上调表达，5 个成员下调表达（图7A）；此外，3个雄性不育材料共有6个BrPRX成员，其中有5 个均下调表达，仅1 个上调表达（图7B）。表明这些基因在白菜生殖生长中具有重要作用，其异常表达可能影响白菜的育性。

3 讨论

图7 BrPRX家族差异表达基因在雄性不育材料中的转录组表达（A）与维恩图（B）分析Fig.7 RNA-Seq analysis(A)and Venn plot(B)of BrPRX differentially expressed genes in three male sterile lines

拟南芥与白菜在完成分化之前曾经发生3次全基因组复制事件（α、β、γ），随后二者出现了分化；白菜基因组在540 万—900 万年前又发生了全基因组三倍化事件[30]。在拟南芥中鉴定出了73 个AtPRX基因，理论上白菜中PRX基因数量应为200个左右，但仅鉴定出121 个BrPRX 成员，推测BrPRX 家族基因在基因组倍化过程中发生了基因丢失事件。白菜的其他基因家族中也有类似现象，如MADSbox[31]、WRKY[32]等转录因子。据报道，片段重复和串联重复均对玉米PRXs[33]的扩增有贡献，而片段重复主要对中国梨PRXs[13]的扩增有贡献。在本研究中，我们发现存在大量串联重复基因，因此推测，串联复制对白菜PRXs 的扩增也有贡献。此外，共线性分析发现，白菜98 个PRX 基因与拟南芥65 个PRX基因存在共线性，表明基因复制导致BrPRX基因数量增加了近1倍，显示白菜经过三倍化事件后，由于基因丢失致使白菜基因的数量约为拟南芥的2倍。

基因结构的多样化在基因家族的进化中发挥着重要作用[13,34]。本研究对BrPRX基因结构进行了研究，结果显示，121个BrPRX基因含有数量不等的外显子和内含子，且来自不同亚家族的BrPRX呈现出不同的特征；此外，对不同组织的RNA-Seq 分析发现，不同BrPRX 基因具有组织表达特异性，说明BrPRX 在功能上具有多样化。对基因结构研究还发现，部分BrPRX 基因缺失内含子，这可能是由特定途径引起的[35]。

拟南芥与白菜PRX 基因系统发育树分为5 个簇，其中：簇1～簇4 较为均匀地分布着拟南芥和白菜PRX 基因，尤其是簇1 中拟南芥与白菜有较高的同源性；但在簇5中BrPRX基因数量较多，可能是由于拟南芥PRX基因在长期进化过程中发生了丢失。共线性分析表明，白菜PRX家族基因与拟南芥PRX家族基因存在高度同源性。此外，顺式作用元件分析表明，BrPRX基因在光响应、激素调控、抗逆性及生长发育等过程中发挥着重要的作用，进一步说明BrPRX基因在抵抗胁迫方面具有积极作用。

前人研究表明，第Ⅲ类过氧化物酶涉及广泛的生理过程，如细胞生长、细胞壁松弛和木质化、非生物和生物应激反应以及果实生长成熟和植物衰老等[1]，但其在植物生殖生长发育过程中的研究很少。本研究利用不同组织转录组数据分析BrPRX 家族基因的表达量，发现部分BrPRX家族成员具有特异性表达，且存在超高量表达和不表达的成员，其中多个基因在花及角果组织中表达量较高，表明这些BrPRX 基因参与了生殖生长过程。为进一步分析BrPRX 基因在生殖生长过程中的功能，利用不同雄性不育花蕾转录组数据分析其表达量，结果显示，3 个雄性不育材料中共有5 个BrPRX 基因下调表达，1个BrPRX基因上调表达，表明这些基因可能与白菜PERK 基因家族具有类似功能，即参与花粉发育，其异常表达可能导致白菜雄性不育[36]。

本研究对白菜PRX 家族基因进行了鉴定和相关功能分析，初步表明，白菜PRX 家族基因在胁迫响应与生长发育过程中可能参与重要的调控作用，为进一步分析白菜PRX 家族基因在生物或非生物胁迫及其生长发育中的功能和作用奠定了基础。