支气管肺泡灌洗液病原菌检测方法及其在儿童肺炎诊治中的应用进展

李香凝，王金堂

湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000

肺炎是我国5岁以下儿童死亡的主要原因之一，发病急，进展快，病程长，以发热、咳嗽、咳痰等为主要临床症状，其病原菌包括细菌、病毒、非典型病原菌（如支原体、衣原体等）和真菌，感染方式包括单一病原菌感染和混合感染，混合感染在肺炎病原菌感染中占重要比例［1］，常引起临床症状严重的肺炎［2］，对患儿的健康生命和家庭负担造成极大威胁。临床早期治疗肺炎多采用经验性用药，但因为近年抗生素的广泛使用，小儿肺炎致病菌对抗生素的耐药性越发严重［3］，多重耐药菌株感染率也逐年升高［4］，对于病程较长和免疫低下的肺炎患儿还需警惕真菌感染，这均可导致早期经验性用药无效，加快病情进展，预后不良。早期快速诊断病原菌，针对性合理用药，可有效提高肺炎患儿尤其是重症、难治性肺炎及经验性用药无效的肺炎患儿的治疗疗效，从而达到缓解病情，改善预后，降低住院率及30天内病死率的目的［5］。已研究显示［6］支气管肺泡灌洗液（BALF）为标本检测病原菌的特异度、灵敏度、检出率及标本合格率均高于痰液。运用纤维支气管镜管道的柔软性到达肺部病灶处收集灌洗液作为标本，在一定程度上避免了口腔定植菌的干扰，增加了标本的可靠性和合格率，从而增加了病原菌的检出率［7］。儿童肺炎支气管肺泡灌洗液病原菌检测方法主要有4种：使用培养基进行病原分离培养的病原菌培养法、对特定病原菌DNA进行扩增的聚合酶链式反应法（PCR法）、新型恒温病原菌核酸扩增的环介导等温扩增技术（LAMP）和基于高通量直接检测病原菌核酸的宏基因二代测序（mNGS），这4种检测方法对小儿肺炎的病原菌诊断、指导用药和评估治疗疗效均具有重要意义，但各自有不同的优势和局限性。现对支气管肺泡灌洗液病原菌检测方法及其在儿童肺炎诊治中的应用进展进行综述。

1 病原菌培养法在儿童肺炎诊治中的应用

传统病原菌培养法是将灌洗液标本接种到培养皿上，置于35℃、5%CO2条件下进行培养，观察培养基菌落生长并筛选分离可能的致病菌进行鉴定，且在培养出菌落后，进行药敏试验，检测菌株对相应药物的敏感性和耐药性。整个操作过程复杂，耗时较长，要求无菌环境，需避免外界细菌污染标本或致病菌污染环境。不同的病原菌适用的培养皿、培养条件和操作均不同，这就需要操作人员具备扎实的理论知识和专业熟练的操作技能。培养法是儿童肺炎BALF病原菌检查方法中最常用的检测技术。

BALF培养法检出病原菌是肺炎病原菌诊断的金标准，在肺炎病原菌诊断中应用最为广泛长久，具有深厚的实验研究基础，且费用不高，是肺炎患儿入院后的基础检查。但患儿在取标本前早已使用过抗生素，常导致标本培养阳性率低，且培养法操作复杂，要求严格，标本在培养全过程中易受污染，这就对标本取样合格、培养环境及操作人员操作技术具有较高的要求，导致培养法病原菌检出率低。吴巧等［8］、张小华等［9］、宋卫娜等［10］的研究显示灌洗液培养病原菌检出率分别为53.3%（32/60）、47.7%（51/107）、21.1%（48/228），吴巧等、张小华等的研究检出率高于宋卫娜等研究的检出率，这可能与研究的患儿年龄、季节、区域及操作过程有关。因部分病原菌难以培养（如鲍特菌、病毒等）和非典型性病原菌（支原体、衣原体等）经普通培养方法具有较高的假阴性，导致培养法漏诊率较高。且培养法耗时较长，一般细菌培养需24～48 h，结核分枝杆菌需培养3～4周，很难达到早期快速诊断病原菌的需求。

因BALF培养法从标本取样到得出结果大多超过3 d，无法早期快速诊断病原菌，在肺炎早期治疗中没有太多优势，但培养法在培养出菌落后，可在培养基上对菌落进行药敏试验，得出菌落对各类抗生素的敏感度和耐药性，不仅可为病菌耐药的流行趋势提供参考依据，还可为肺炎中期治疗抗菌药物的选择和调整提供指导依据。吴巧等［8］、张小华等［9］、宋卫娜等［10］的研究均表明，根据BALF培养致病菌的种类和药敏性针对性调整抗生素使用后，患儿的临床症状和肺部影像学表现均得到好转，治愈率达到84.1%～100.0%，平均住院天数显著下降，预后良好。培养法可在治疗中期指导调整抗生素用药，选择敏感性较高的药物针对性治疗，不仅可以改善患儿临床症状和预后，减轻患儿的痛苦和家庭经济负担，还可避免抗生素的滥用，降低耐药菌株和超级细菌的出现。

2 PCR法在儿童肺炎诊治中的应用

PCR法是一种无需分离病毒和细菌或培养细胞，只需利用放大扩增特定的基因片段来检测临床标本中的病原菌的检测方法。因PCR只能应对一对引物，检测一种致病因子，故临床上常将其与其他技术进行整合检测病原菌。基于PCR原理的多重聚合酶链式反应（mPCR），mPCR是在同一PCR反应体系里加入两对以上引物，可以同时扩增多个核酸片段，可同时检测多种病原微生物。检测DNA标本的为基于荧光检测的定量实时PCR（Q-PCR），检测RNA标本的为逆转录定量实时PCR（RT-Q-PCR），临床上常将多重和实时定量技术结合，这体现了高效、简便、经济的优点，但PCR检测对环境及仪器设备要求较高，无法区分定植菌和致病菌［11］。

在肺炎病原菌诊断中，PCR技术是除培养法外最常用的病原菌检测方法，能够在较短的时间内检测出多种致病菌的存在，可显示肺炎感染病菌是单一感染还是混合感染，且不受抗生素使用的影响，为儿童肺炎病原菌诊断提供了一种快速、敏感的诊断方法［12-13］。PCR利用DNA和RNA片段的扩增，可有效检测病毒、细菌及支原体等，临床上常用PCR技术检测病毒和支原体，在支原体感染诊断中作用尤为突出，将支原体PCR RNA检测作为肺炎支原体诊断金标准［14］。GUO等［15］发现，经多重实时荧光PCR技术，108例患儿BALF病原菌检出率为78.7%，其中单一病原体感染检出率48.1%，多重病原体感染率30.6%。谢乐云等［16］采用荧光定量PCR法检测的149例肺炎患儿BALF，共检出病原体129例，其中混合感染23例。BALF PCR检测病原菌的特异度及敏感度高，具有高检出率。但PCR局限于需要特定目标基因的优先序列数据，依赖特定引物的特异度，只能用于已知基因序列的检测，对未加入病原菌目的基因的病原菌造成漏诊，同时PCR技术无法区分定植菌和致病菌，亦不能进行药敏试验［17］。

PCR技术因其快速、经济、病原菌检出率较高的特点，为肺炎早期治疗抗菌药物的选择提供重要参考依据，但其无法检测致病菌对药物的敏感性和耐药性，这对早期治疗选择抗生素的使用存在一定的局限性，无法选择药敏性较高的药物进行早期治疗，在一定程度上影响肺炎早期治疗的疗效。通过PCR检测病原菌，可有效区分致病菌为病毒、细菌还是支原体，从而有效选择治疗药物，避免抗生素的滥用。PCR技术在儿童肺炎治疗疗效评估中也具有重要的作用，主要表现在支原体感染后治疗的疗效评估，支原体DNA的FQ-PCR定量检测通过其拷贝数来反映支原体感染患儿的病情，使患儿病情评估得到量化，有助于儿童支原体感染尤其是难治性支原体感染的精准诊疗［18］。但若将PCR与培养法结合，不仅病菌检出率增高，还可以检测菌株的药敏性［19］，对早期肺炎治疗疗效具有高效保障。

3 LAMP在儿童肺炎诊治中的应用

LAMP是由NOTOMI等于2000年报道［20］的一种新型快速核酸扩增技术，其原理是通过对目标基因的6个特异区域设定4种引物，在65℃恒温条件下依赖一种具有链置换活性的DNA聚合酶，生成自我循环扩增的颈环结构，使得目标基因在短时间内大量、高效地扩增，无需经过模板的加热变性、长时间温度循环、电泳、紫外观察等过程，仅需1 h即可完成实验，可用于细菌、非典型性细菌（支原体、衣原体、嗜肺军团菌）、病毒、真菌、寄生虫和结核杆菌的快速诊断。LAMP所需设备简易，操作简单，极适用于发展中国家的病因诊断及传染病的检测［21］。

LAMP在小儿肺炎病原菌诊断中常用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒，利用恒温扩增芯片技术检测呼吸道常见的13种病原菌，包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、耐甲氧西林葡萄球菌和结核分枝杆菌复合群，具有较大的诊断价值。LAMP在诊断病原菌时可在1 h内完成检测实验，2 h内可完成从取样至出结果全过程，能够有效达到早期快速诊断病原菌的目的。LAMP芯片法能从微量拷贝中获得目的基因，不受抗生素使用的影响，具有较高的检出率，且LAMP检测时设定有Tp值，在一定时间内扩增拷贝数达到一定数量才可判定为阳性，有效区分定植菌与致病菌，减少假阳性发生，还可避免交叉反应、免疫抑制状态出现假阴性［22-23］。杨雪飞等［24］研究显示，LAMP病原菌检出率为56.7%，显著高于培养的25.0%；研究［25］表明，LAMP比QRT-PCR检测支原体有更高的敏感性和特异度。LAMP芯片法虽可同时检测13种常见呼吸道病原菌，但对一些不常见的病原菌造成漏诊。但总而言之LAMP芯片法因其耗时短、检出率高、敏感性高、特异度高及易操作性的优点，使得其成为最有前途的即时病原菌诊断方法之一［26］。

LAMP能够早期快速诊断儿童肺炎病原菌，故对小儿肺炎早期精准靶向治疗具有重要参考价值［26］。WANG等［27］根据LAMP检测结果对16例肺炎患儿调整药物靶向治疗，所有患儿3 d病情好转，缓解率84.2%。杨雪飞等［24］依据LAMP检测结果对肺炎患儿使用抗生素，抗感染治疗时间（14.3±2.9）d，住院时间（14.5±3.2）d，均显著低于初始治疗未覆盖病原体组，而初始治疗有效率86.2%高于初始治疗未覆盖病原体组的40.0%。由此可见，LAMP检测结果对肺炎患者早期选择和调整药物后的治疗疗效具有重要意义。虽然LAMP可检测出部分菌株的耐药基因，却存在无法检测出菌株对药物的敏感性的局限性，但总体来说LAMP对于多数的呼吸道感染病原体能够有效检出，具有高于培养法和PCR的特异度和敏感性，有效提高了抗生素治疗的覆盖率和针对性，为儿童肺炎早期治疗抗生素的使用提供的重要的参考依据，且有效避免了抗生素的滥用［28］。

4 mNGS在儿童肺炎诊治中的应用

mNGS是基于高通量测序技术主要运用于临床检测病原菌的方法，无需培养，能无偏移地将标本中所有病原体的核酸都检测出来，可有效避免漏检。高通量测序技术理论上能检测所有已知病原体，较其他检测方法测序通量更高，测序速度更快，可早期、快速、精准鉴定儿童肺炎特别是重症或难治性肺炎的病原菌。mNGS检测病原菌种类全面，包括细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体、寄生虫、螺旋体、立克次体，可检测出常规手段无法检测出的病原菌，且能同时检测出多种病原体与多重感染的情况。

mNGS结合了高通量测序的阳性率高和宏基因高灵敏度的优点，且不受抗生素及厌氧环境的限制，在12～24 h内获得结果［29］，提高细菌、病毒、真菌及特殊病原体的检出率，且能够有效检出培养法无法检测出的病原菌［28］，并能检测多重感染的情况，为儿童肺炎病原菌诊断尤其是疑难、危重、特殊肺炎病原菌诊断提供快速精准的新方法。柯创宏等［30］发现，高通量测序法细菌检出率和敏感度均高于细菌培养法。余世庆等［31］认为，mNGS和恒温扩增核酸检测检出率菌高于传统培养法，而mNGS检出率高于LAMP。且在同一BALF标本中，mNGS的特异度及灵敏度高于PCR检测［32］。但也存在一定的局限性，mNGS能检测出标本中的所有微生物，故而不能区分检出病原菌的性质是否为致病性，需临床医生结合临床症状及实验室报告和影像学检查做出判断，且无法检测病菌的药敏性［33］。

mNGS对儿童肺炎的早期治疗有着重要的意义，尤其是疑难、危重、特殊肺炎，进行mNGS检测后，明确致病微生物，及时调整治疗，可有效改善患者的临床症状，缩短平均住院时长，效果优于经验性的“广覆盖”治疗。BALF mNGS检测敏感性高、确诊快，避免了长期使用及滥用抗菌药物，实现精准治疗，从而缩短病程，提高救治成功率。研究显示，通过mNGS早期明确诊断后，调整治疗方案，患者90 d生存率从57.7%提高至83.3%。

综上所述，肺炎早期的诊疗中PCR、LAMP和mNGS占据重要的位置，能够早期快速诊断病原菌，及时指导药物治疗，但无法检测致病菌的药敏性。mNGS的检出率虽高于其他检测方法，但存在费用昂贵，要求技术水平高，对RNA病毒保存不易，真菌和结核菌提取DNA相对困难等问题，缺乏统一、完善的检测流程和质量控制标准的局限性。若能尽早建立完善抗生素耐药基因库，进一步完善技术，降低成本，减轻经济负担，并将mNGS与灌洗液培养、PCR、LAMP进行平行送检，形成早期快速诊断体系，可为儿童肺炎早期病原菌诊断和早期精准治疗做出更完善的参考依据和指导作用。