低浓度二甲双胍对肝癌细胞株Huh-7迁移、侵袭能力的影响及其机制

殷威达，吴秋秋，刘一帆，刘季芳，陈纪涛

广州医科大学附属第五医院，广州510700

世界范围内肝癌（HCC）发病率位居恶性肿瘤的第五位，病死率高居第三位［1］。我国每年大约40万人死于HCC，占全球HCC死亡总数的51%［2］，给社会和家庭带来沉重负担。目前，HCC首选、最有效的治疗方法是手术切除，但该病早期无典型症状，一旦确诊往往处于晚期，肝功能受损严重，耐受性差，导致大部分患者失去手术机会［3］。即使HCC患者获得根治性切除，5年内仍有60%～70%的患者出现复发转移［4］。此外HCC对放、化疗均不敏感，总体来说患者预后仍不理想。哺乳动物中丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）通过磷酸化丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）的活性，进而启动Warburg代谢进程促进肿瘤细胞的异常增殖，作为4种异构体之一的PDK4在调控PDC蛋白物质代谢中扮演着靶标的角色［5-6］。文献［7-9］报道，药物通过调节PDK4的表达调控PDC，进而影响糖代谢和脂代谢，HCC细胞主要利用糖酵解作为能量来源，而糖、脂代谢对于肿瘤的增殖异常重要。二甲双胍作为一种经典的治疗Ⅱ型糖尿病药物，前期研究发现低浓度二甲双胍通过诱导HCC细胞衰老抑制其增殖［10-11］。最近体外研究也发现，PDK4表达缺失促进HCC细胞增殖、致瘤性和侵袭转移［12］，敲低PDK4能够上调关键脂肪生成酶的表达促进HCC细胞的增殖和迁移［13］。但二甲双胍能否通过调控PDK4蛋白表达抑制其增殖和迁移、侵袭目前尚未报道。2020年7—10月，我们观察了低浓度二甲双胍对HCC细胞侵袭、转移能力的影响，并探讨其机制，旨在为HCC的治疗提供新的理论基础及治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂及仪器HCC细胞Huh-7购自中国科学院细胞库。二甲双胍盐酸盐（Sigma公司），Transwell 24孔板、Matrigel基质胶（Corning公司），PDK4抗体（Abcam公司）。多功能酶标仪（美国，BioTEK），细胞计数仪（美国，Countstar IC-1000）、倒置荧光显微镜（德国，Leica），正置荧光显微镜（德国，Leica）、化学发光成像系统（美国，ChemiDoc XRS+），Western blot系统（美国，Bio-Rad）。

1.2 二甲双胍干预后的Huh-7细胞迁移率测算 采用细胞划痕实验。取对数生长期的Huh-7细胞，以胰酶消化，用含10%FBS的DMEM高糖培养基终止消化，再均匀铺到六孔板中，六孔板背面画上5条相互平行的横线，放入细胞培养箱培养过夜。次日细胞长满后再将培养基弃去，用PBS清洗3遍，用200µL枪头沿着直尺垂直横线分别划各孔细胞，再用PBS清洗划痕处漂浮的细胞，各孔分别加入1和0 mmol/L二甲双胍（分别记为观察组和对照组），再放入37℃、5%CO2细胞培养箱培养48 h，分别于24、48 h时用倒置显微镜拍照，计算迁移率。

1.3 二甲双胍干预后的Huh-7细胞侵袭细胞数计算 采用细胞侵袭（Transwell）实验。用无血清DMEM培 养 基 将 基 质 胶 稀 释 至200µg/mL，将100µL基质胶缓慢加入Transwell小室，37℃培养箱中培养2 h。将对数生长期的Huh-7细胞分别用1和0 mmol/L二甲双胍处理24 h（分别记为观察组和对照组），用胰酶消化后细胞计数，用无血清DMEM高糖培养基稀释至5×105个/mL，加200µL在各小室，再分别在下室各孔中分别加入750µL含10% FBS的DMEM高糖培养基，十字摇匀，放细胞培养箱培养24 h。用无菌棉签拭去基质胶和小室未侵袭的细胞，各下室弃去培养基后用PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min。再弃去多聚甲醛，用PBS清洗2次，再加入1%结晶紫染色40 min。PBS洗去小室多余结晶紫后，在正置显微镜下观察，随机选取5个视野进行拍照，计算侵袭细胞数。

1.4 二甲双胍干预后的Huh-7细胞PDK4 mRNA检测 采用葡萄糖代谢芯片。将处于对数生长期的Huh-7细胞分别用无血清DMEM高糖培养基配制成的1、0 mmol/L二甲双胍处理24 h（分别记为观察组和对照组），送到上海康成生物科技有限公司做葡萄糖代谢芯片，通过用TRIzol法提取总RNA，经过检测、纯化、探针杂交等步骤，对葡萄糖代谢芯片的数据进行差异表达和功能富集分析，评估二甲双胍对PDK4 mRNA表达的影响。

1.5 二甲双胍干预后的Huh-7细胞PDK4蛋白检测 采用蛋白免疫印迹实验。取对数生长期Huh-7细胞，分别用1、0 mmol/L二甲双胍处理24 h，加入裂解液，裂解完转至离心管，4℃下以12 000 r/min的速度离心20 min，取部分上清用BCA法测蛋白浓度，剩余上清加入5×Loading buffer，煮10 min蛋白变性后-20℃保存。上样电泳：冰上操作，根据蛋白浓度上样，上样量为50µg，80 V电泳，条带分开和样品压成直线时调为120 V，条带跑到电泳槽底部终止电泳。转膜：转膜槽保持低温，100 V转膜120 min。封闭：5%脱脂牛奶中封闭2 h。敷一抗：根据蛋白分子量剪膜，加入根据抗体说明书稀释好的一抗，4℃冰箱摇床过夜。敷二抗：回收一抗，洗膜3次后再加入BSA稀释好的二抗，室温摇床孵育1 h。显影：洗膜3次，打开Image Lab系统，加入显影剂曝光，检测PDK4蛋白。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞迁移率、侵袭数比较 观察组干预24、48 h细 胞 迁 移 率 分 别 为40.14%±2.40%、84.02%±3.85%，对 照 组 分 别 为100.00%±0.00%、170.10±7.48%，两组比较，P均＜0.05。观察组干预24 h细胞侵袭数为（183.20±17.13）个，对照组为（403.60±17.31）个，两组比较，P＜0.05。

2.2 两组PDK4 mRNA、蛋白相对表达量比较 观察组及对照组PDK4 mRNA相对表达量分别为1±0.01、1.84±0.01，两组比较，P＜0.05。观察组及对照组PDK4蛋白相对表达量分别为0.53±0.01、0.44 ±0.01，两组比较，P＜0.05。

3 讨论

2020中国临床肿瘤学会（CSCO）HCC治疗指南数据显示，全球每年HCC新发病例一半以上来自中国；在中国范围内，HCC位居恶性肿瘤的第四位，致死率高居第二位，严重威胁着国民的健康，给家庭和社会带来沉重的负担。HCC的治疗手段主要有手术、放化疗、介入、免疫和靶向治疗，虽然取得了很大的进步，极大地改善了患者的预后，但5年生存率仍不尽人意［14-15］。目前，治疗HCC疗效最好的治疗手段是手术切除和肝移植，但早期无明显症状体征、疾病进展快、易肝内外转移、癌栓侵犯大血管等因素严重制约手术开展［16］。如果能抑制HCC细胞向远处转移，对于增加手术切除机会提高患者生存率具有重要意义［17］。临床工作中我们发现，慢性肝炎极易损伤肝脏组织，导致患者肝功代谢异常引起肝硬化，严重时可使肝细胞发生癌变，导致HCC的发生。能量代谢异常是实体瘤细胞的基本特征之一，因此从逆转HCC代谢重编程的角度去探讨，对于HCC的治疗具有十分重要的意义。

代谢方式的改变对于肿瘤的发生发展至关重要，丙酮酸脱氢酶激酶家族在肿瘤发生中起关键作用。PDK4作为4种丙酮酸脱氢酶激酶亚型之一，是糖酵解和氧化磷酸化途径的关键酶，调控整个代谢网络使其适合肿瘤的生长［18］。最新研究发现，PDK4基因敲除可以增强HCC细胞的增殖能力，促进HCC细胞迁移、侵袭［12］。YANG等［13］亦发现，敲低PDK4明显增加脂肪合成关键酶如脂肪酸合成酶（FASN）和硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）的表达，最终诱导脂肪生成，同时促进HCC细胞的增殖和侵袭迁移，据此推测PDK4可能通过下调脂肪生成来抑制HCC细胞的增殖和迁移侵袭能力。在接受多模式治疗的转移性HCC患者中，上调PDK4表达可降低肝化疗诱导的氧化应激，并与术后肝功能改善相关［19］。这些发现表明，PDK4表达缺失可促进HCC的恶性进展从而影响临床预后，上调PDK4则有助于改善HCC患者预后，而PDK4也被发现在肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌中起到抑癌作用［20-22］。肿瘤抑制因子在癌症中经常被下调，我们进一步查询The Human Protein Atlas和Gepia Cancer两个数据库，体内实验结果发现HCC组织中PDK4蛋白低表达，HCC中PDK4表达升高的患者，5年生存率显著提高。以上体内外实验结果提示，PDK4蛋白表达可能与HCC肝内外转移密切相关。

本课题组前期研究中葡萄糖代谢芯片结果发现，低浓度二甲双胍处理HCC Huh-7细胞后，与对照组相比，PDK4 mRNA的表达明显升高。而PDK4蛋白表达又和HCC细胞迁移、侵袭密切相关，那是否低浓度二甲双胍能够通过上调该蛋白的表达抑制其转移能力？我们分别采用细胞划痕和Transwell两种经典实验方法验证，结果发现低浓度二甲双胍确实抑制HCC细胞的迁移、侵袭。为进一步验证二甲双胍通过调控PDK4抑制HCC细胞迁移、侵袭能力，接下来我们采用1 mmol/L二甲双胍处理HCC细胞，实验结果证实其能够显著上调PDK4蛋白表达。但在HCC中，二甲双胍通过调控PDK4蛋白抑制其侵袭的具体机制，目前还需进一步阐明。

总之，二甲双胍能抑制HCC Huh-7细胞的迁移和侵袭，机制可能与其可调控PDK4蛋白表达有关。PDK4有望成为抑制肝癌侵袭转移的新靶点，为肝癌的靶向治疗提供新的研究方向。