香豆素衍生物荧光探针研究进展

魏含笑，张乐华，王英骥

（哈尔滨医科大学药学院，哈尔滨 150081）

香豆素荧光探针具有光学活性好、荧光量子产率高、Stokes 位移大、溶解性好、光稳定性强等优点，在化学、生物学、临床生物化学和环境学领域备受关注。目前市售的荧光探针种类繁多，但功能单一，仅用于分析检测。天然产物香豆素不仅具有优良的药理活性，而且分子结构中含有发光基团，因而设计开发具有治疗及检测双重作用的新型香豆素荧光传感器成为研究热点。

香豆素类化合物的基本母核为苯骈α吡喃酮，具有优良的荧光性能，活性位点多样且易于结构改造，香豆素本身具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗骨质疏松、保护心血管系统等药理作用，其7、8 位为主要活性修饰部位，对其主要活性部位进行修饰，合成新的香豆素衍生物荧光探针，在香豆素母核上引入特定的官能团，可扩大其在生物学领域中的应用。近年来，已报道的香豆素衍生物荧光探针研究成果与日俱增，设计合成的香豆素类荧光探针具有多种用途且应用价值较高，尤其在生物医学和环境领域的应用较为突出，包括检测重金属离子、含硫化合物、活性氧、蛋白质以及监测细胞结构等。笔者对近5 年来设计合成的香豆素荧光探针在检测过氧化氢、一氧化氮、次氯酸根离子、含硫化合物、细胞结构、毒性物质等方面的应用研究进展进行了综述。

1 检测过氧化氢

Li 等［1］采用苯并噻唑-2-基-7-羟基香豆素与3-(苯并噻唑-2-基)-7-羟基香豆素结合生成一个环形配体，得到双氧水的中性铱络合型磷光探针，苯硼酸频哪醇酯为特异性识别位点。该探针在室温的可见光激发下即可显示出高效的磷光发射，使其对生物体的损害降至最低，由于探针和过氧化氢反应可引起特异性硼酸降解，其对过氧化氢的选择性优于其它活性氧，为设计对过氧化氢特定识别位点的荧光探针提供了理论依据。

Velusamy 等［2］基于香豆素和萘酰亚胺的结合设计了检测外源性和内源性H2O2与H2S 的双通道荧光探针。该探针无毒，可用于癌细胞标记，在癌症诊断方面具有潜在应用价值。

Han 等［3］设计出一种同时检测H2O2与HClO的荧光探针，可作为研究H2O2与HClO 在氧化应激中相互作用的工具。

Zhang 等［4］以4-二乙胺水杨酸为原料，经6 步法合成检测过氧化氢的荧光探针，该探针已经成功用于细胞腔内单光子显微镜和双光子显微镜成像。

2 检测一氧化氮

一氧化氮（NO）是人体内重要的内源性物质，是目前所知最强的血管舒张因子和收缩因子，其作用极其广泛，它可作为介质、信使或细胞功能调节因子参与机体许多生理与病理过程，并与部分疾病的发生相关，因此监测活细胞中的一氧化氮含量对深入探究一氧化氮的作用机制至关重要。

Han 等［5］报道了基于香豆素的荧光探针，用于生物系统中的一氧化氮检测，以香豆素为信号单位，氨基硫脲为识别单位，在一氧化氮存在的情况下，探针FP–NO 与一氧化氮快速选择性反应，产生的FP–P 具有高荧光，从而间接检测一氧化氮，一氧化氮检出限为47.6 nmol／L。FP–P 兼具生物相容性和活细胞膜通透性，用于MCF–7 细胞外源性一氧化氮和炎症J774A 细胞外源性一氧化氮的成像和流式细胞术分析，实现了活斑马鱼外源性和内源性NO 生产的可视性，为研究活生物体中一氧化氮作用机理提供理论依据。

Zhang 等［6］设计合成出两种一氧化氮探针，分别为尼罗红的对苯二胺衍生物和香豆素的邻苯二胺衍生物，后者可同时作为良好开关型NO 荧光探针及双光子荧光探针的荧光团。该课题组开发的具有良好组织型纤溶酶原激活物（TPA）活性的一氧化氮探针，为构建更多基于光诱导电子转移原理（PET）的无响应双光子荧光传感器提供了结构–性能关系的理论基础。

Sadek 等［7］设计出一种检测巨噬细胞中NO 的荧光探针，该探针与NO 能够进行特异性反应，可作为细胞成像的潜在工具。

Wang 等［8］合成出对NO 具有高选择性和灵敏性的荧光探针，已成功用于水溶液中NO 的荧光检测。

3 检测次氯酸离子

次氯酸是中性粒细胞和单核细胞产生的毒性最强、丰度最高的强氧化剂，可快速攻击包括硫醇、硫醚、胺类、氨基酸、核苷酸、抗坏血酸和多烯酸等多种生物分子。同时，次氯酸与双氧水和超氧阴离子反应可分别生成单线态氧和羟基自由基，而单线态氧和羟基自由基是检验活细胞功能正常与否的重要标志。

Wang 等［9］设计合成出一种以香豆素衍生物作为荧光团、二甲基氨基甲硫基氯和硫化物作为调制器的荧光探针，该探针对次氯酸选择性好，响应性能显著，能够在60 s 内对溶液中的次氯酸作出反应，检测下限为34.75 nmol／L，表明该荧光探针可以用来定性检测活细胞中不同浓度的次氯酸，以及自来水中的次氯酸。

Shangguan 等［10］开发了基于香豆素染料和丙二腈的荧光探针，该荧光探针用于检测环境中的次氯酸根离子和活细胞中的氯离子，其检测波长为459 nm，检测限为5.7 nmol／L，检测时间小于15 s。该荧光探针工作机制为碳碳双键被氯氧化生成醛，三坐标测量机探针（CMM）位上的取代基双键被氧化成醛，在与次氯酸根离子反应时产生一个与甲酰香豆素(［m+Na］+)相对应的新峰m／z227.031 2，表明探针CMM 向醛的产物发生了转化，得到较强荧光。该探针对环境水样中的氯离子定量测定具有较高的准确度，已成功用于检测MDA–MB–231 细胞中的氯离子。

Tang 等［11］合成了用于检测生物体内氯离子和铜离子的双功能香豆素荧光探针11，该探针对ClO–与Cu2+的检出限分别为24.62 nmol／L 和0.39 nmol／L，检测时间分别为5 s和30 s。其检测原理是：ClO–与Cu2+使探针8 位上的C—N 键氧化断裂成C—O 键，从而引起颜色变化，ClO–颜色由黄色变为无色，Cu2+由黄色变为亮黄色。该探针对ClO–、Cu2+均表现出良好的选择性和灵敏性，研究表明，此探针对环境水样的检测具有潜在意义。

4 检测含硫化合物

4.1 检测硫化氢

Yang 等［12］报道了检测活细胞中硫化氢的α，β-不饱和乙酰香豆素荧光探针，该探针具有强荧光特性，与硫化氢发生迈克尔加成反应致使荧光猝灭，可用于检测活细胞中存在的硫化氢，检出限为5×10–8mol／L，优于报道的大多数检测硫化氢用荧光探针。

Jin 等［13］设计合成一种以香豆素为母核的3-(E)-3-(1H-吲哚-3-基)丙烯酰-2H-铬酮-2-1 探针，用于快速检测水溶液中的硫化氢，其检出限为3.3×10–8mol／L。该探针显示出低细胞毒性，在活细胞中与硫化氢的成像表现为红色荧光显著增强。

Zaorska 等［14］报道一种检测硫化氢的荧光探针4-甲基-2-氧基-2-H-色氨酸-7-基-5-叠氮戊酸盐，其对生理pH 条件下的磷酸钠缓冲液和唾液中硫化氢的检测具有高度的灵敏性，在唾液中硫化氢的检出限达到微摩尔数量级。

4.2 检测二氧化硫

作为机体的内源性物质之一，二氧化硫参与多种生理调节，其浓度异常会导致多种疾病发生，开发简便、快速识别二氧化硫在生物体内变化的荧光探针至关重要。

Song 等［15］以香豆素和苯并吡喃荧光团为基础，构建出线粒体靶向比率荧光探针，用于检测活细胞中的二氧化硫。该探针有强烈的蓝色和红色荧光，快速响应二氧化硫后，在433 nm 下荧光明显增强，在683 nm 下荧光明显减弱。活斑马鱼体内成像实验表明，该探针具有组织通透性，对二氧化硫有较高的灵敏度和选择性，可在生物体内的两个发射通道检测二氧化硫，目前已经成功用于活细胞和斑马鱼线粒体中二氧化硫的检测。

Kong 等［16］合成出一种新型香豆素类比色荧光探针，在近红外和双光子双模下用于二氧化硫的检测。该探针具有稳定性好、选择性高、响应速度快(10 s)、Stokes 位移大、检测限低等优点，且具有近红外发射、双比色和荧光检测能力。研究表明该探针是探索生物体内二氧化硫生理和病理活动的有效分析工具。

Xu 等［17］报道了一种亲脂性阳离子染料检测内源性SO2衍生物，成功用于HeLa 细胞内二氧化硫衍生物的检测。

5 检测细胞结构

5.1 检测半胱氨酸

Wang 等［18］设计合成了一种检测同型半胱氨酸的香豆素二聚体荧光探针，该探针具有响应速度快、灵敏度高、选择性好等优点。

Chen 等［19］设计出一种溶酶体靶向半胱氨酸荧光生物传感器，在生理条件下可对半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等多种天然氨基酸产生荧光启动反应，在520 nm 处荧光显著增强，已成功用于小鼠器官组织和HeLa 细胞的L-半胱氨酸（Cys）荧光成像。该探针对溶酶体内的半胱氨酸具有靶向性，而且具有生物相容性，可作为蛋白质标记物或疾病监测工具。

Ma 等［20］将识别单元2，4-二硝基苯磺酰基酯和香豆素衍生物相结合，开发了一种用于检测半胱氨酸的新型荧光探针，该探针对半胱氨酸有高选择性，可在水基缓冲液中与半胱氨酸反应，有良好的水溶性和生物相容性，其检出限为23 nmol／L，已经成功用于活细胞中半胱氨酸的成像。

5.2 内质网成像

Wijesooriya 等［21］合成两种含有磺胺侧基的香豆素类化合物用于内质网成像。该类化合物对HeLa 和GM 07373 哺乳动物细胞内质网具有选择性，且对这些细胞的毒性较低，IC50值为205～252 μmol／L。研究表明，以香豆素为基础的探针更适用于发出黄色和红色荧光的多色成像，而且在活细胞和固定细胞中实现内质网标记，在细胞成像应用中具有通用性。

5.3 检测线粒体

Qi 等［22］设计合成两种香豆素／荧光融合荧光染料，这些染料很容易引入其它基团来设计不同的功能分子，并且这些染料对pH 值在4.0～7.4 范围内的反应是快速而灵敏的，表明这两种染料不仅具有良好的细胞膜通透性和较低的细胞毒性，而且能够快速监测活细胞线粒体pH 变化。

5.4 检测脂滴

脂滴是细胞内中性脂类(包括甘油三酯和胆固醇酯)的主要储存场所，其功能障碍会导致糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化等多种疾病。

Chen 等［23］以2-氨基芳基酮和3-乙酰-7-二乙胺香豆素为原料，利用Friedlander 法合成两种喹诺酮–香豆素衍生物，这两种衍生物光稳定性好，在弱酸至碱性溶液中均具有较强的荧光性，且具有较高的荧光量子产率（0.79～0.96），合成的衍生物可以作为活细胞和细胞中脂滴的标志物。

6 检测毒性物质

6.1 检测肼

肼是一种常用的化学还原剂，对人体和环境具有高毒性。Shi 等［24］以双乙酰氧基为反应位点，设计合成了一种用于检测肼的双乙酰氧基类荧光探针，检测下限为2.98 nmol／L，检测速度较快(10 min)，该探针可用于蒸馏水中肼以及HepG–2 人肝癌细胞的检测。

6.2 检测氰化物

氰化物对生物体的毒性巨大，极少量即可导致生物死亡，原因是氰化物在细胞色素中与氧化酶形成稳定的复合物，抑制酶的活性，阻断细胞获得氧，导致细胞窒息，因此开发一种检测氰化物的方法至关重要。

Sun 等［25］设计合成一种新型香豆素查尔酮衍生物荧光探针，用来识别CN–和生物硫醇，其优点是具有良好的灵敏度、选择性以及抗干扰性。该探针存在两个亲核加成位点，香豆素1 位上与CN–发生迈克尔加成反应，在4 位上也发生CN–加成，迈克尔加成法将CN–及生物硫醇与探针的碳碳键结合，阻断了分子内电荷转移，导致吸收峰降低和荧光猝灭。

7 展望

香豆素类衍生物是天然药物化学中的一类重要化合物，具有明显的抗凝血、抗肿瘤以及抗人类免疫缺陷病毒的生物活性，同时香豆素及其衍生物具有很好的光学性能，其荧光量子产率高，Stokes 位移大，溶解性好，光稳定性强，能够广泛应用于荧光探针领域。以香豆素为母体合成的荧光探针已应用于医学、生物和环境领域，可检测重金属离子、含硫化合物、活性氧、蛋白质以及监测细胞结构等。目前，香豆素类荧光探针主要存在合成成本高、合成路线复杂、污染环境等问题。综上所述，基于香豆素母核为荧光发射团，寻找一些新的合成位点、识别位点和作用机制，设计出一系列具有高选择性、高灵敏性、操作简单、光稳定性好、溶解性好、无毒或低毒类的荧光探针是今后的研究方向。