猪细小病毒病灭活疫苗纯化浓缩技术研究

李应鹤，初晓红，宋 扬，徐 刚，李 贽，于 镭

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

猪细小病毒病是危害全球养猪业的三种重要传染病之一，给养猪业带来了巨大的经济损失。因此，为了预防和控制这类疾病，应用安全、高效的疫苗是最主要的解决途径。为了探索浓缩纯化后的病毒液的免疫效果，本试验拟采用中空纤维柱浓缩纯化技术对猪细小病毒L株灭活病毒液进行过滤纯化，并制备成灭活疫苗进行安全与效力检验[1-2]。

1 材 料

1.1 制苗用病毒液

猪细小病毒L株灭活病毒液（灭活前病毒液红细胞凝集价为1∶512，病毒含量为107.36TCID50·mL-1），由哈药集团生物疫苗有限公司制备和提供。

1.2 主要试剂

MontanideTMISA 206 VG佐剂，购自法国赛比克公司；2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA），购自Sigma 公司；0.02 mol·L-1PBS、氯仿等原料，购自国药集团；其他试剂均为国产分析纯级。

1.3 红细胞凝集抑制抗原

猪细小病毒L株，批号为PPV-HI Ag-201401，红细胞凝集价为1∶512，规格为1.0 mL·瓶-1，由哈药集团生物疫苗有限公司制备和提供。

1.4 中空纤维超滤浓缩系统

中空纤维超滤浓缩系统，华泰净化技术工程有限公司提供。

1.5 红细胞悬液

0.5%豚鼠红细胞悬液，按现行《中国兽药典》制备。

1.6 试验动物

2～4日龄豚鼠，体重350～400 g，猪细小病毒HI抗体效价低于1∶8，由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供；1.5～2 月龄的仔猪（猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI 抗体不超过1∶8），购自黑龙江省哈尔滨市郊某猪场，品种为长白。

2 方 法

2.1 病毒液纯化与浓缩

2.1.1 病毒液澄清

按程序安装澄清用的0.45 μm的中空纤维柱及管路，用25%乙醇清洗中空纤维柱内的保存甘油，再用纯化水冲洗，然后以2%NaOH 循环清洗中空纤维柱并浸泡过夜，再用纯化水清洗中空纤维柱内残留碱液至中性并测定水通量，用PBS平衡中空纤维柱。无菌连接中空纤维柱的进液、回液与透过液，将病毒液进行澄清处理。

2.1.2 中空纤维浓缩纯化

安装规格为100 ku 中空纤维柱及管路，再用2%NaOH 循环清洗中空纤维柱并浸泡过夜，然后用纯化水冲洗中空纤维柱内残留碱液至中性并测水通量。用无菌PBS平衡中空纤维柱。无菌连接中空纤维柱的进液和回液后进行浓缩处理，处理时保持泵转数在15%～20%。每批样品分别浓缩20倍，用PBS连续洗滤浓缩液2～3次，以洗滤出液体计算洗滤次数。

2.1.3 病毒液重悬

按猪细小病毒原液量1/2 体积（即相当于最终进行2倍浓缩）加入PBS溶液，重悬后即得2倍浓缩的病毒液。

2.2 疫苗配制

分别用猪细小病毒灭活原液和2倍浓缩液分别配制3 批疫苗。原液配制的3 批疫苗批号分别为YY-201401、YY-201402 和 YY-201403，2 倍浓缩液配制的3 批疫苗批号分别为NS-201401、NS-201402和NS-201403。

2.3 检测

2.3.1 红细胞凝集价的测定

分别对猪细小病毒原液、2倍浓缩液以及中空纤维浓缩滤过液进行红细胞凝集价的测定。

2.3.2 安全检验

用乳鼠检验：用2～4 日龄乳鼠30 只，随机分为6 组，每组5 只，各经皮下注射疫苗0.1 mL，设条件相同的对照乳鼠5只，相同环境下饲养，观察7 d[3]。

用猪检验：用断奶后1.5～2月龄猪12头（猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI 抗体不超过1∶8），随机分为6组，每组2头，各经深部肌肉注射疫苗5 mL，设条件相同的对照猪2 头，相同环境下饲养，观察21 d。

2.3.3 效力检验

用体重350～400 g 猪细小病毒HI 抗体效价低于1∶8的豚鼠30只，随机分为6组，每组5只，分别肌肉注射疫苗0.5 mL。28 d后连同条件相同的未注射对照豚鼠2只，采血，测定HI抗体效价。

3 结果与分析

3.1 红细胞凝集价测定结果

从浓缩前后红细胞凝集价测定结果看，猪细小病毒原液与2倍浓缩液红细胞凝集价无差异。

3.2 安全检验结果

从疫苗的安全检验结果可以看出，猪细小病毒原液配制的疫苗和2倍浓缩液配制的疫苗在安全检验上都是安全的，但从本动物安全检验体温检测指标上比较，原液配制的疫苗一过性体温总体要高于2倍浓缩液配制的疫苗。

3.3 效力检验结果

从疫苗的效力检验结果上看，两种疫苗免疫豚鼠，各组免疫豚鼠有5/5出现抗体反应，其HI抗体效价均不低于1∶64。

4 结 论

验证的纯化浓缩工艺采用0.45 μm的中空纤维柱去除细胞碎片，采用规格为100 ku空纤维柱对猪细小病毒原液做20 倍浓缩，然后按不低于原液量1/2 体积的PBS 液重悬后作为浓缩抗原。用猪细小病毒原液和2倍浓缩液分别配制疫苗，对两种疫苗的安全检验、效力检验结果进行比较。结果显示，上述两种疫苗安全检验、效力检验结果均符合规定，但2倍浓缩液配制的疫苗安全性明显优于原液制备的疫苗，证明该纯化浓缩工艺是有效可行的。