免疫时代肿瘤放疗值得关注的研究方向*

刘成新 李宝生

山东第一医科大学附属肿瘤医院放疗科，山东 济南 250117

恶性肿瘤是一种基因突变引起的细胞生长相关的疾病，原癌基因激活及抑癌基因失活引起自身免疫系统监视功能紊乱是导致肿瘤发生、增殖和转移的重要因素。虽然长期以来免疫治疗被寄予厚望，但直到最近几年，以免疫抑制剂为代表的免疫治疗才逐渐成为肿瘤治疗领域关注的焦点，被认为是继手术、放疗、化疗、靶向治疗之后的又一重要的肿瘤治疗方法。因此，肿瘤免疫治疗被Science列为2013年十大年度科学突破之一。

1 免疫检查点抑制剂治疗相关进展

免疫检查点抑制剂通过阻断免疫抑制检查点以及激活效应T细胞和髓系细胞中的免疫刺激检查点(如CD226和CD28)发挥作用。免疫抑制检查点主要通过与CD3/CD28依赖性信号的干扰、B7家族与共刺激分子的竞争性中断或抑制信号传导到肿瘤细胞或T细胞来抑制免疫反应，其中两个检查点，即程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞蛋白-4(CTLA-4)已成为关注的焦点。2011年美国食品和药物管理局(FDA)批准靶向CTLA-4的全人单克隆抗体用于转移性黑色素瘤治疗。2014年12月22日，FDA批准PD-1抑制剂nivolumab(Opdivo，百时美施贵宝)用于治疗无法切除或转移性黑色素瘤，拉开了免疫治疗肿瘤的序幕[1]。

尽管免疫治疗给肿瘤患者带来希望，但单用免疫检查点抑制剂治疗的应答率较低，联合传统抗肿瘤手段的综合治疗是免疫发展的方向。既往研究发现，化疗可以在一定程度上发挥正向免疫调节作用，增强机体的抗肿瘤免疫应答[2]。这主要是因为化疗可以诱导免疫原性肿瘤细胞死亡并且增加肿瘤细胞表面抗原的表达，从而增加免疫治疗的疗效。此外，化疗可以调节外周血和肿瘤病灶免疫微环境中各免疫细胞亚群的比例及其功能，降低抑制性免疫细胞的比例，增加具有抗肿瘤作用的效应淋巴细胞，从而增强抗肿瘤免疫应答。肿瘤联合抗血管生成治疗亦有明显获益优势。肿瘤血管分布杂乱紊乱、通透性不均质，超过一半的肿瘤血管是无功能的，导致肿瘤组织微环境处于高渗透压、乏氧、酸化的状态，药物难以渗入并作用于肿瘤细胞。抗血管生成不仅可以诱导肿瘤血管正常化，还可以促进肿瘤CD8+T淋巴细胞的浸润及免疫药物与肿瘤细胞的全面接触，从而提高治疗效果[3]。在联合治疗中，笔者认为免疫联合放疗更值得关注，下面简述之。

2 放疗与免疫治疗结合的理论基础

2.1 放疗诱导的免疫原性细胞死亡及免疫检查点的表达

放疗除了直接破坏肿瘤细胞外，还可以激活免疫反应，即肿瘤“原位”疫苗效应[4]。放疗可调节多种免疫反应过程，如抗原释放和呈递，T细胞启动、活化、募集和在肿瘤中的聚集，以便识别和杀伤肿瘤细胞。免疫原性细胞死亡诱导释放肿瘤相关抗原(TAA)，如放疗后濒死的肿瘤细胞可主动或被动释放细胞死亡相关分子(CDAMP)，被肿瘤微环境中的免疫细胞上的受体(PRR)捕获，触发肿瘤细胞与免疫系统间的“对话”，从而激活免疫监视[5-6]。放疗还可通过IFN-γ间接调节肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞表面免疫检查点表达水平，如PD-L1[7],鉴于肿瘤内PD-L1的过表达与抗PD-L1治疗反应有关，因此，放疗可作为一种有效的辅助治疗，以提高免疫检查点阻断治疗的有效性。

2.2 放疗诱导免疫细胞的肿瘤浸润并激活局部免疫炎症反应

放疗通过3种不同的机制影响免疫细胞向肿瘤微环境浸润：血管结构改变，粘附分子表达的增加和趋化因子分泌。放疗可以诱导IL-1β、TNF-α及干扰素上调VCAM-1在肿瘤内皮的表达，促使T细胞在肿瘤中的浸润增加[4,8]，还可诱导中性粒细胞快速和短暂浸润，通过释放活性氧(ROS)消灭肿瘤细胞[6]。除此之外，放疗还具有旁观者效应，指来自受照射细胞的信号可影响邻近的未受照射组织，对照射部位以外的肿瘤细胞也产生抑制作用，如放疗对巨噬细胞产生直接活化作用，巨噬细胞产生旁观者信号，导致周围组织放射性损伤的发生[9-10]。放疗还对肿瘤微环境有绝对效应，即“在同一机体内，距被辐照的体积一定距离的一种作用”[11]。绝对效应是免疫系统反应，主要由树突状细胞(DC)和巨噬细胞介导，并由源自肿瘤微环境的炎性因子激活。这些细胞激活后迁移至肿瘤淋巴结及远处未照射部位，如NK细胞、CTL和Th细胞在淋巴结中激活后，迁移到远处的肿瘤部位，通过促炎反应，引起未受照射肿瘤细胞的抑制[12]。CTL激活后不仅迁移到受照射的肿瘤部位，还可迁移到远处的转移部位诱发绝对效应。在受照射的肿瘤微环境中，活化的T细胞还分泌许多细胞因子，参与肿瘤免疫监视并且抑制其生长，如放疗激活的T细胞产生的TNF，可导致局部和全身性MDSC的直接消除[12]。

2.3 放疗激活免疫反应

放疗的免疫刺激作用可通过多种途径触发，如增加NK细胞和CD8+细胞毒性T细胞对肿瘤的浸润、提高肿瘤相关M1巨噬细胞的积累、降低浸润调节性T细胞(Treg)水平、增加Fas和IFN-γ表达以及抑制PD-1/PDL-1途径等[13]。肿瘤微环境转变是放疗的间接作用，电离辐射增加了细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)分子的数量[6]，导致钙网蛋白(CRT)易位，释放HMGB1蛋白以及ATP和HSPs的分泌，进而激活DC[14],增强抗原呈递，促进免疫反应的发生。

3 免疫时代肿瘤放疗值得关注的几个研究方向

3.1 高、低放疗剂量

不同放疗剂量和放疗方案，可获得不同的免疫应答。根据不同剂量分割方式可以募集并激活各种类型的免疫细胞，T细胞对辐射的敏感性取决于其活化状态，静止T细胞受辐射的影响要大于其活化形式[15]，而Treg比其他T细胞对辐射抵抗力更高。另一方面，B细胞表现出高放射敏感性，在放疗后呈递抗原和产生抗体能力降低[12]。巨噬细胞比单核细胞对放疗抵抗力更高，但是在非常高的放疗剂量(高达30 Gy)辐射下，内皮细胞仅表现出很小的表型变化[16]。

1953年，“远隔效应”的发现证明放疗和免疫相辅相成的作用，该效应的部分理论基础被认为是与体部立体定向放疗(SBRT)介导的局部免疫效应细胞的激活有关[17]。SBRT所使用的较高单次辐射剂量可诱导免疫原性肿瘤细胞死亡，引起抗原、死亡相关分子模式(DAMP)配体和Toll样受体大量释放，进而激活抗原呈递细胞APC[9]。研究发现，非小细胞肺癌患者SBRT较常规放疗更能激活机体的免疫应答作用[18]。在黑色素瘤小鼠模型中，两种剂量分割模式照射对比发现，不同分割方式均可引起树突状细胞及CD8+T细胞浸润[19]。单次剂量15 Gy的放疗可提高黑色素瘤小鼠淋巴结中APC的水平、增加IFN-γ产生诱导抗肿瘤反应。小鼠中12～18 Gy的高剂量放疗可激活DNA核酸外切酶Trex1降解胞质DNA，诱导免疫原性触发[20]。免疫反应产生的I型IFN激活DC等APC[26]，15～20 Gy的辐射剂量诱导DC等APC成熟和迁移并提高T细胞抗肿瘤反应水平，增加肿瘤内免疫细胞浸润[22-23]。然而，临床上对于局部晚期癌症如肺癌、食管癌，同步放化疗是过去数十年来的标准治疗，提高放疗剂量的研究基本都未得到阳性结果，这可能与照射范围较大的情况下，高剂量放疗会增加心脏等正常组织器官损伤及免疫抑制有关。

然而，研究发现，放疗剂量低于4 Gy时可导致细胞死亡，而高剂量有可能会引发危险信号的释放，从而激活适应性免疫，同时产生TGF-β等免疫抑制信号[24]。低剂量放疗可使血管趋向正常化，促进T细胞浸润到肿瘤产生抗肿瘤反应[25]。低剂量放疗还可刺激血管生成和血管新生过程，而高剂量放疗反而会抑制此过程的发生[22,26]。由于低剂量放疗引发的促血管生成作用迅速且维持时间短，因此，2 Gy/d的常规放疗剂量分割方案可能会反复刺激血管生成的发生[26]。当缺氧的肿瘤细胞再次获氧后可发生“肿瘤再氧化”，氧气的重新分布有助于提高放疗疗效，促进肿瘤细胞死亡[21]。黑色素瘤小鼠全身放疗可降低Treg水平、增加效应记忆T细胞频率[27]。低剂量放疗也可诱导内皮细胞上ICAM-1和E-选择素的表达，促进免疫细胞渗入肿瘤微环境。单次剂量约2 Gy的辐射可以募集肿瘤特异性CD8+和CD4+T细胞至肿瘤，也可以诱导巨噬细胞表型从M2型向M1型转化，从而诱导肿瘤血管正常化[28]。试验发现，适应性免疫的最佳诱导放疗分割剂量可能较传统2 Gy大3倍，小鼠模型表明较高的分割剂量可刺激肿瘤细胞释放足够多新抗原、DAMP及免疫刺激分子[29]。同时，研究还说明分割次数而非单次剂量放疗更能引起免疫介导的绝对效应。低剂量放疗也可激活免疫抑制和血管生成。在小鼠实验中，低剂量放疗可诱导M2巨噬细胞生成精氨酸酶、TGF-β和IL-10，进而抑制抗肿瘤反应并促进肿瘤转移。小鼠实验表明，常规分割放疗可增加MDSC数量，而给予超分割剂量放疗后反而降低其数量[30]。2 Gy/d的放疗(而非单次高剂量放疗)可增加PD-L1在肿瘤细胞表面的表达[20]。

卢铀教授团队[31]最新研究阐述了低剂量放疗对肿瘤微环境调控及联合抗PD-1治疗的协同作用机制，在此基础上进一步揭示了低剂量放疗强化高剂量放疗的系统性免疫效应及其与免疫治疗联合的协同增效机制，探索了低剂量放疗、大分割放疗联合免疫治疗的三联治疗方案，其疗效在荷瘤小鼠动物模型和回顾性临床数据中得到了初步验证。

目前免疫治疗与放疗联合的最佳剂量分割尚不清楚，免疫细胞和肿瘤脉管系统之间在不同剂量辐射下的相互作用需要进一步深入研究。

3.2 不同放疗方式及范围

SBRT可通过诱导主要组织相容性复合物(MHC)I、炎性介质、共刺激分子、热激蛋白、免疫调节细胞因子、黏附分子和死亡受体细胞表达，增强免疫治疗的抗肿瘤效应。在寡转移或寡进展的非小细胞肺癌患者中，SBRT与针对EGFR突变、ALK易位及PD-1/PD-L1抑制剂联合应用，可改善患者无进展生存期(progression-free survival，PFS)和潜在的总生存期(overall survival，OS)，并且在寡进展环境中可以克服特定病变的获得性耐药性。在转移人群中，SBRT与PD-L1为主免疫治疗联合应用时，通过远隔效应和绝对效应增强对转移灶的作用，显著改善患者OS，提高生存率。另外，由于SBRT照射范围小、分割次数少，对淋巴结等免疫相关器官影响小，且能够产生有利于免疫的新抗原。因此，其与免疫治疗联合具有独特的优势。然而，局部晚期肿瘤患者，放疗范围需包括原发肿瘤、受累淋巴结甚至其他高危淋巴结引流区，由于照射范围大，并不适合前面提到的SBRT。临床上通常采用3D-CRT、IMRT、IGRT等常规分割的放疗技术，在免疫治疗时代，这些放疗技术如何优化，值得我们关注。研究显示，与高剂量照射范围相比，较低剂量的辐射范围，尤其是肺V5～10与淋巴细胞最低点关联更大，当患者淋巴细胞水平较低时，对免疫治疗的反应可能性降低，通常也会伴随着较差的临床结局，因此，应特别注意免疫治疗中IMRT的低剂量辐射范围问题。除此之外，IMRT患者接受治疗后CD3+/CD4+比率下降,CD3+/CD8+比率呈明显上调，而3D-CRT患者则变化相对较小，这可能与IMRT治疗时间长，受照射的血流多有关。

免疫时代，放疗范围对免疫系统的影响也是非常值得关注的。当我们在累及野(IFI)和选择野(ENI)之间进行选择时，需要进一步考虑放射线与免疫系统之间的相互作用，因为淋巴结既是淋巴细胞也是淋巴细胞克隆成特定抗原的储存库。此外，对于食管癌、肺癌等胸部肿瘤放疗时，循环淋巴细胞在穿过心脏、大血管的过程中会受到不同剂量的辐射，且整个心输出量也通过肺循环进行转移，因此更容易受辐射影响。临床研究也发现，NSCLC患者的淋巴细胞耗竭与较差的预后有关，尤其与免疫治疗联合时，对免疫治疗反应的可能性较低。在临床前研究中，采用ENI的SBRT结合免疫检查点封锁，抑制免疫浸润，可使肿瘤趋化因子表达减弱，存活率降低。

IMRT可以对CTV提供足够的剂量覆盖，而省略CTV可以减少对正常组织的损伤。CTV免除在临床应用中也被证明是可以接受的。一项105例III期非小细胞肺癌患者的回顾性研究显示，靶区中是否包含CTV在局部复发、远处转移、PFS、OS和3～4级放射性食管炎或血液学毒性方面无统计学意义，并且在未接受CTV的患者中3～4级放射性肺炎的发生率明显较低。因此，省略CTV似乎是可行的。值得注意的是，较大的靶区不仅会增加正常组织损伤，还会对淋巴系统造成更多损害。因此，与免疫治疗相结合时，如何充分利用先进的多模态影像及人工智能、大数据等技术，更加精准的确定放疗靶区，在治疗肿瘤的同时，如何最大限度的保护淋巴免疫系统，是未来重要的研究方向。

3.3 剂量率

剂量率也是影响放射生物效应的重要因素，目前研究尚不充分。除低剂量率和常规剂量率放疗外，近年来超高剂量率(≥2400 Gy/min)放疗(又称FLASH技术)引起业界高度关注。上个世纪80年代，就曾有低剂量率放疗能提高免疫系统功能的报道。单次低剂量率X线全身照射可以引起一系列免疫学参数刺激效应,表现为T细胞特别是辅助性T细胞的功能激活,导致抗体形成和细胞毒性增强，此外，低剂量率放疗还可以调节神经内分泌，从而调节免疫功能。目前将免疫与FLASH放疗效应联系起来的证据都是相关性的，而非因果关系，尚不清楚FLASH技术照射(FLASH-RT)后哪些免疫反应会导致FLASH效应。Girdhani课题组发现，质子FLASH-RT可以降低正常组织毒性，后期分析显示这与FLASH-RT后小鼠免疫系统广泛激活和成熟受抑制有关。另外还发现，通过CD3+T淋巴细胞向肿瘤内募集，FLASH质子辐射改善了肺肿瘤的局部控制。然而，由于肿瘤微环境中的T细胞/组织驻留记忆T细胞比循环/淋巴组织T细胞更耐辐射，FLASH-RT并不能保护小鼠心脏和脾脏的免疫细胞。鉴于此，FLASH-RT后的免疫应答是否影响FLASH效应非常值得关注并深入探讨。

3.4 不同放射线

治疗肿瘤的放射线可分为以光子为代表的低LET和以质子、重离子为代表的高LET两种。近期研究表明，质子和光子放疗均能诱导参与免疫识别的表面分子(组织相容性白细胞抗原、细胞间粘附分子1以及与肿瘤相关的癌胚抗原和粘蛋白1)的上调；与光子治疗相比，质子显著下调PD-L1并诱导肿瘤细胞表面钙网蛋白表达水平，增加了对肿瘤细胞杀伤T淋巴细胞的敏感性；不过，肿瘤干细胞对质子放疗的直接细胞杀伤具有抗性，因此放疗后引起钙网蛋白上调方式与普通肿瘤细胞相同。由于质子放疗诱导了肿瘤中增强T细胞介导的抗肿瘤活性，因此，当与T细胞介导的免疫治疗结合使用时，质子治疗或表现出其他放射源治疗所不具有的优势，突显了其在抗肿瘤反应中的新兴作用。DC充当专门的抗原呈递细胞，并在摄取肿瘤抗原后启动抗肿瘤免疫应答中起关键作用。越来越多证据表明，碳离子放疗与DC免疫治疗相结合具有抗转移作用，可显著降低小鼠模型中肺转移的数量。在另一项研究中，DC免疫治疗与低剂量碳离子辐照联合应用，可显著增强抗转移作用，而与光子放疗联合时则需要更高的放射剂量才可发挥抗转移作用。此外，与碳离子放疗联合应用时，静脉内DC注射比肿瘤内DC给药可更有效地抑制肺转移。在临床实践中，就碳离子治疗深部肿瘤的优势而言，静脉内DC注射也更合适。碳离子辐照过程中钙网蛋白在细胞表面的上调和未成熟DC的活化增强了肿瘤细胞的免疫原性，可能有助于碳离子放疗法与免疫治疗之间的相互协同作用。除此之外，在小鼠实验中，接受X线和质子照射的小鼠体内炎症因子的表达水平也表现出明显的不同，受照射后16个月的小鼠，接受X射线辐照的，细胞因子通常被上调，而接受质子辐照的小鼠，细胞因子水平与对照组相比被下调。最大的差异是质子和X射线组之间的差异，其中6种测试细胞因子中有5种差异明显(IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α)。研究发现，接受X线和质子照射5～30天后的小鼠，炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表达水平差异明显，表明质子照射后急性期细胞因子表达改变显著。与质子相比，X射线照射诱导的细胞因子表达变化不明显，IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ的表达在第5天和第30天没有显著变化，而IL-17A和TNF-α在第30天出现下调。提示我们不同射线照射联合免疫治疗可能会产生截然不同的生物效应。

3.5 放疗与免疫治疗结合的时间

由于放疗与免疫治疗存在复杂的相互作用，对免疫治疗和放疗介入时间方案的优化至关重要。关于放疗联合免疫治疗的最佳时机，目前临床上还没有明确的结论。临床研究显示，免疫治疗+同步放疗或免疫治疗+序贯放疗疗效无明显差别[32]。而在PACIFIC研究中，放疗结束后14天内开始免疫治疗的患者，无进展生存期优于超过14天者。LUN14-179实验也得到类似结论。抗CTLA4和抗OX4治疗的最佳放疗时间不同，表明放疗介入时机在不同免疫治疗中可能具有特异性[33]。研究发现，与放疗后给予免疫治疗相比，放疗同步免疫治疗的患者预后更好，该结果说明免疫治疗和放疗联合作用可启动血管正常化和免疫刺激正反馈回路，诱导肿瘤内血管向正常化转变，增强放疗和免疫治疗的疗效[34]。尽管免疫治疗在部分患者中获得较好的治疗效果，但与放疗等其他手段联合时，可能增加的不良反应也是临床所关注的。目前放疗与不同免疫治疗药物之间时序方面的最佳组合，尚无定论，不同联合方式临床获益与风险之间的平衡需要在未来的临床试验中进一步探索，这方面已有许多临床研究正在进行，相信随着研究的不断深入，放疗与免疫治疗时序优化会给患者带来更大的帮助。

3.6 指导放疗对免疫治疗反应的标志物

尽管以PACIFIC研究为代表的放疗联合免疫治疗取得了成功，但仍难令人满意。目前为止，已经报道了放疗后和放疗期间免疫反应的许多候选生物标志物，主要包括：①血常规，如淋巴细胞计数、中性粒细胞计数等；②循环免疫细胞亚群，如T细胞亚型、MDSCs及肿瘤抗原特异性淋巴细胞；③细胞表面标记，如PD-1、PD-L1、FAS配体及肿瘤抗原特异性细胞T细胞；④淋巴细胞活性的功能水平测定；⑤肿瘤浸润淋巴细胞，如CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肿瘤抗原特异性TIL；⑥循环炎症标记物，如C反应蛋白、乳酸脱氢酶、白蛋白；⑦肠道菌群，如拟杆菌、柔嫩梭菌和甲酸芽殖菌等[35]。然而，准确预测标志物仍然是摆在人们面前的难题，这是实现个体化精准治疗、提高疗效、减少损伤的关键，值得关注。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突