两种独行菜种子萌发对不同浓度NaCl胁迫的响应

李天永，严子柱，姜生秀

(1.甘肃祁连山国家级自然保护区管理局上房寺自然保护站，甘肃 武威，733000； 2.甘肃省荒漠化与风沙灾害防治重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地/甘肃省治沙研究所, 甘肃 兰州, 730070)

盐碱地是世界上一类重要的土地资源，全世界目前有盐碱地约9.54×109hm2，我国约有0.99×108hm2，主要集中在西北、华北和东北地区[1]。土壤盐碱对区域生态环境建设和农业生产具有重要影响，是影响植物生长发育和农业可持续发展的非生物胁迫因子之一[2]。草本植物是盐碱地生态植被重要组成成分，有些是先锋植物或建群种，对盐碱地生态修复有重要作用[3]。草本植物对盐碱生境的适应性机理研究是盐碱地生态修复与治理的科学依据，草本植物能否在盐碱地中生活则取决于种子能否正常萌发[4]。种子萌发期是植物生活史的初始期，也是植物生活史中最重要和最脆弱的时期[5]，同时也是植物适应环境变化、保持自身繁衍特性的重要生理时期，决定着植物能否在干旱或盐碱环境中成功定居[6]。盐胁迫严重影响植物种子萌发和幼苗生长[7]。在高盐碱条件下，植物生理代谢会发生较大变化，种子的发芽率和萌发速率反映了种子萌发受到的抑制程度[8]。对盐胁迫最为敏感的时期为种子萌发期，这阶段的耐盐能力在一定程度上反映了植物整体耐盐性[9]。长期以来，人们对盐胁迫下植物耐盐性进行过深入研究，尝试传统育种法和现代生物技术来提高植物的耐盐性，取得了一定的成果[6-10]。但目前，对植物盐胁迫的响应研究多以中性盐NaCl为对象[11]。

腺独行菜(L.apetalum)和宽叶独行菜(L.latifolium)是我国西北干旱荒漠区盐碱地上常见的两种草本植物，主要分布在干旱、半干旱荒漠地带的低山山地、丘陵下部、山间盆地、山前平原、间歇性河床上，多散生，部分集中分布，少有大面积集群分布的情况，是我国干旱、半干旱盐碱地上宝贵的建群种和药用植物，对我国盐碱地生态植被重建与修复以及盐碱地改良具有非常重要的作用[12-13]。种子是这两种独行菜种群扩大和个体繁殖的唯一途径，不仅对荒漠生态系统生物多样性、生态服务功能及稳定性有极其重要的作用，还具有广泛的资源开发和利用前景[14]。近年来，相关盐碱地草本植物种子萌发受盐碱胁迫影响的文献很多，如:苜蓿(Medicagosativa)种子[11]、猪毛蒿(Artemisiascoparia)种子[5]、盐爪爪(Kalidiumfoliatum)种子[15]、黑麦草(Loliumperenne)[16]等，但盐胁迫对腺独行菜和宽叶独行菜种子萌发的影响研究鲜有报道。本文用不同浓度NaCl溶液代表不同程度盐胁迫，对腺独行菜和宽叶独行菜种子萌发及幼苗生长特征进行了研究和分析，深入了解了两种独行菜种子萌发的耐盐性特征，为两种独行菜在盐碱地植被恢复过程中的应用提供了科学理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用腺独行菜和宽叶独行菜种子，2019年7月采于民勤县薛百乡长城村附近多年退耕盐碱地(38°34′23.18″ N,102°58′47.26″ E)。种子千粒重7.01 g，籽粒饱满、大小适中、无病虫、光泽度好；经自然晒干熏蒸消毒后，放入恒温5℃、恒湿40%的SDC-1600种子冷藏柜中保存3个月。

1.2 试验方法

种子发芽试验2019年11月进行。先用5‰高锰酸钾溶液浸泡种子1 h，再用自来水反复冲洗将种子清洗干净。将发芽用玻璃培养皿置于105℃烘箱中高温杀菌2 h，冷却后置入滤纸两张，将配制好的浓度为50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1，200 mmol·L-1，250 mmol·L-1，300 mmol·L-1的NaCl溶液各5ml加入培养皿，以蒸馏水(0 mmol·L-1)为对照CK，置入供试种子各30粒，重复3次。放入25℃的种子恒温培养箱，用箱暗发芽，每天更换滤纸和相同浓度的NaCl溶液。种子萌发自种子置培养皿之日起观测，以胚根长等于种子长为标准[17]。将3个重复中最早有1粒种子发芽之日作为该处理发芽开始期，以后每天下午17:00时记录种子发芽数，当连续4 d不再有种子发芽时作为发芽结束期。种子萌发试验结束后，各重复中随机选取5粒发芽种子测定胚芽长和胚根长[18]。计算发芽率和发芽势，同时以发芽结束时对照处理的各项指标记作100%，计算不同处理各指标的相对值。由上述指标和新生根长度等判定种子萌发对不同浓度NaCl溶液模拟土壤盐分的敏感性[19]。

GR=SN1/SN0×100%[20](式中GR为种子发芽率(%)，SN1为供试种子萌发数，SN0为供试种子总数)。

GP=SNm/SN0×100%[21](式中GP为种子发芽势(%)，SNm为种子发芽达到最高峰时种子发芽粒数，一般以最初1/3天数内发芽种子数计)。

DGR = n/SN0×100%[22](式中DGR为日相对发芽率，n为相应各日正常发芽粒数，SN0为供试种子总粒数)。

Gr=Σ(D×n)/ Σn[23](式中Gr为平均发芽速率，D为种子自置床起算的天数，n为相应各日正常发芽粒数)。

1.3 数据处理

试验数据用Excel和GraphPad Prism 5软件进行统计分析和作图。单因素多重比较采用q检验法[21]计算：LSRα,k= q(df,k)×Sx；式中：α为显著水平0.05和0.01；df为自由度，k为秩次距，Sx是平均值标准误。

2 结果与分析

2.1 两种独行菜种子发芽率对盐胁迫的响应

如图1所示，不同浓度的NaCl胁迫处理下，两种独行菜种子萌发情况完全不同。不同盐浓度处理下，腺独行菜种子发芽率随NaCl浓度增加呈开口向下的抛物线变化，峰值(87.77%)出现在NaCl浓度150 mmol·L-1处，响应曲线近于y=-1.177x2+8.5016x+71.271(R2=0.7881)。这表明，随盐胁迫浓度增加，腺独行菜种子发芽率呈先升高后降低的趋势。轻度盐胁迫促进了种子的萌发，而重度盐胁迫则抑制种子萌发。宽叶独行菜种子发芽率响应曲线与腺独行菜的完全不同。随NaCl浓度增加，宽叶独行菜种子萌发率持续降低，其趋势线方程为：y=1.827x2-21.044x+58.905(R2=0.9742)，且当NaCl浓度≥200 mmol·L-1时，种子的发芽率均为零。这表明，NaCl胁迫在一定程度内(0

2.2 两种独行菜种子发芽势对盐胁迫的响应

由图2可知，不同浓度的盐胁迫处理，两种独行菜种子的发芽势变化趋势基本相同，都随盐胁迫程度加重而呈下降趋势。其中腺独行菜种子发芽势曲线符合方程y=0.463 9x2-7.2433x+50.486(R2=0.949)，而宽叶独行菜种子的发芽势曲线则符合方程y=0.7286x2- 7.4881x+17.857 (R2=0.8961)，其中x∈{0，150}，即当NaCl浓度高于150 mmol·L-1时，宽叶独行菜种子发芽势为零，完全失去了发芽力。而对同程度的盐胁迫而言，腺独行菜种子发芽势远高于宽叶独行菜种子。这表明，盐胁迫对两种独行菜种子的发芽能力都有明显的抑制作用，且随盐胁迫程度加重，两种独行菜种子的发芽能力都显著减小，其中宽叶独行菜种子在NaCl浓度达到150 mmol·L-1时，种子的发芽能力完全丧失。

图1 不同盐胁迫两种独行菜种子发芽率Fig.1 Germination rates of two kinds of Lepidium L. seed treated with different salt stress

图2 不同盐胁迫处理两种独行菜种子发芽势Fig.2 Germination potential of two kinds of Lepidium L. seed treated with different salt stress

2.3 两种独行菜种子平均发芽率对盐胁迫的响应

由图3可知，不同盐胁迫处理，腺独行菜种子平均发芽率响应曲线基本一致，均表现为种子置床后第2 d发芽，2 d～6 d内发芽率迅速增大，第7 d达最大值，7 d后几乎不再萌发，各处理间差异均不明显。但从腺独行菜种子发芽不同时期来看，发芽初期(1 d～4 d)各盐胁迫处理种子发芽率变化顺序为：GRCK>GR100>GR50>GR150>GR200>GR300>GR250，均低于对照CK，说明这一时期腺独行菜种子萌发均受到了盐胁迫的抑制作用，种子发芽率均低于对照；发芽中期(5 d～7 d)种子发芽率发生了变化，顺序为：GR50>GR100>GR150>GR200>GRCK>GR300>GR250，说明这个时期，轻度(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1)和中度(150 mmol·L-1，200 mmol·L-1)盐胁迫促进种子萌发，种子发芽率升高，而重度(250 mmol·L-1，300 mmol·L-1)盐胁迫仍然抑制种子萌发，发芽率较低；发芽末期(7 d～9 d)，发芽率顺序为：GR50= GR150>GR100>GR200>GRCK>GR300≥ GR250，说明不同程度的盐胁迫对腺独行菜种子的促进或抑制作用已成定势，发芽情况变化不大。

由图4可知，不同盐胁迫处理，宽叶独行菜种子发芽率响应曲线在各处理间差异明显，总体发芽率顺序为：GRCK>GR50>GR100>GR150>GR200=GR300=GR250=0。这说明不同盐胁迫程度对宽叶独行菜种子萌发都有抑制作用，且随盐胁迫程度加重而抑制作用增强，并当盐胁迫程度达到NaCl浓度为200 mmol·L-1时，完全抑制了宽叶独行菜种子的萌发。

图3 不同盐胁迫腺独行菜种子发芽曲线Fig.3 The seed germination curve of Lepidium apetalum treated with different salt stress

图4 不同盐胁迫宽叶独行菜种子发芽曲线Fig.4 The seed germination curve of Lepidium latifolium treated with different salt stress

2.4 两种独行菜种子日相对发芽率对盐胁迫的响应

由图5可知，腺独行菜种子日相对发芽率曲线均为双峰曲线，但不同盐胁迫处理双峰值出现时间不同，这说明腺独行菜种子正常发芽有两次高峰，但受盐胁迫抑制作用发芽高峰出现不同程度滞后。轻度盐胁迫(NaCl浓度50，100 mmol·L-1)下，腺独行菜种子的日相对发芽变化趋势与CK基本一致，两个峰值出现在第2 d和第4 d。这说明轻度盐胁迫对腺独行菜种子萌发的抑制作用较小，没有破坏种子萌发节律，只延缓了部分种子萌发时间。中度盐胁迫(150，200 mmol·L-1)下，腺独行菜种子的日相对发芽曲线与CK不同，两个盐胁迫处理种子日相对发芽率曲线也出现差异。盐胁迫程度为150 mmol·L-1的处理，种子的发芽节律没有发生改变，但峰值延后至发芽第4 d和第5 d；盐胁迫程度为200 mmol·L-1的处理，种子发芽推迟1 d，两个峰值也延后至发芽第5 d和第7 d。这说明中度盐胁迫对腺独行菜种子萌发产生了较大的抑制作用，已经破坏了种子萌发节律，且随胁迫程度加重，明显延缓了种子的萌发时间。重度盐胁迫(250,300 mmol·L-1)下，腺独行菜种子的日相对发芽变化趋势与CK和轻、中度胁迫显著不同，两个胁迫处理种子日发芽率曲线差异明显。盐胁迫程度为250 mmol·L-1的处理，种子发芽峰值延后至第5 d和第7 d，两个峰值均显著小于CK和中、轻度胁迫；盐胁迫程度为300 mmol·L-1的处理，种子发芽推迟6 d，只有一个峰值，且远小于对照和中、轻度胁迫。这说明重度盐胁迫对腺独行菜种子萌发产生了严重的抑制作用，基本上破坏了种子萌发能力和节律。

图5 不同盐胁迫腺独行菜种子日相对发芽率Fig.5 Daily relative germination rate of the Lepidium apetalum seeds treated with different salt stress

由图6可知，宽叶独行菜种子日相对发芽率曲线也是双峰曲线，但与腺独行菜种子的曲线有明显差异，不同盐胁迫处理日相对发芽率双峰值均比CK峰值滞后，且随盐胁迫程度加重，双峰值均变小，并在盐胁迫程度达到NaCl浓度200 mmol·L-1及以上时，宽叶独行菜种子日相对发芽率均变为零。这说明宽叶独行菜种子正常萌发也有两次萌发高峰，发芽规律与腺独行菜种子相似，但宽叶独行菜种子萌发受盐胁迫影响远大于腺独行菜种子受盐胁迫的影响，发芽高峰不仅随盐胁迫程度加重而推迟，而且其萌发高峰出现时间也明显滞后。

图6 不同盐胁迫宽叶独行菜种子日相对发芽率Fig.6 Daily relative germination rate of the Lepidium latifolium seeds treated with different salt stress

2.5 两种独行菜种子胚根胚芽生长对盐胁迫的响应

由图7可知，不同盐胁迫处理对两种独行菜种子胚芽生长均有抑制作用。相比较而言，不同盐胁迫处理，腺独行菜种子胚芽生长均大于宽叶独行菜种子胚芽生长，且差异显著(P<0.05)；特别当NaCl浓度达到150 mmol·L-1以上时，腺独行菜的胚芽仍有生长，且达到了另一个生长高峰，而宽叶独行菜种子胚芽则完全停止生长。这说明，对两种独行菜种子萌发而言，NaCl浓度为150 mmol·L-1的处理是一个阈值；对腺独行菜而言，胚芽的生长达到第二个高峰期，随后受盐胁迫加重影响胚芽生长再次不断受到抑制；而对宽叶独行菜而言，胚芽受盐胁迫影响，完全停止生长。

图7 不同盐胁迫对两种独行菜种子胚芽生长的影响Fig.7 Effect of different salt stress on seed germ growth of two kinds lepidium注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

由图8可知，不同程度的盐胁迫对两种独行菜种子胚根的生长也有抑制作用，且相较于胚芽生长，两种独行菜种子胚根生长对盐胁迫的响应差异更明显。从总体态势来看，两种独行菜种子的胚芽和胚根随盐胁迫程度加重而生长趋势基本一致，只是盐胁迫程度在NaCl浓度150 mmol·L-1时，腺独行菜种子胚根生长没有产生新的峰值，同NaCl浓度为100,200 mmol·L-1的生长基本一样，宽叶独行菜胚根也在此浓度下停止生长。这说明，不同程度盐胁迫，对两种独行菜植物种子的胚芽和胚根生长有抑制作用，但对腺独行菜的抑制作用小，对宽叶独行菜的抑制作用大，即NaCl浓度为150 mmol·L-1是两种独行菜种子胚芽和胚根生长的一个阈值。

图8 不同盐胁迫对两种独行菜种子胚根生长的影响Fig.8 Effect of different salt stress on seed radicle growth of two kinds lepidium

3 讨论

发芽率和发芽势是评价种子质量的重要指标[3]。种子萌发期是盐胁迫最为敏感的时期，这一时期的耐盐能力一定程度上反映了植物整体的耐盐性[9]。一般来说，植物种子发芽率随着盐浓度增加而呈先升后降的趋势，即低浓度盐胁迫能促进种子萌发，而高浓度盐胁迫会抑制种子萌发[24]。这是因为盐分是植物正常生长所必需的营养物质，适量的盐分对维持植物正常生理功能有着重要的作用[25]，而过多的盐分则会通过对植物造成渗透胁迫、离子毒害[26]、干扰营养离子平衡和氧化伤害[27]等作用，滞后种子的萌发时间，推迟植物种子的初始萌发时间[28]。本试验结果显示，NaCl胁迫处理对腺独行菜种子萌发存在高浓度(200,250,300 mmol·L-1)抑制，低浓度(50，100，150 mmol·L-1)促进现象，即随NaCl盐溶液浓度升高萌发率先升后降的特征，这表明一定浓度的盐胁迫可促进腺独行菜种子的萌发，这与Khan等人的研究结果完全一致[24]。但宽叶独行菜种子萌发则存在低浓度(50，100，150 mmol·L-1)抑制、高浓度(200,250,300 mmol·L-1)完全抑制现象，这与何美香等人的研究结果一致[29]。这表明两种独行菜种子萌发对盐胁迫的耐受能力不同，腺独行菜的耐受力大于宽叶独行菜，即腺独行菜比宽叶独行菜更适于盐碱地生长。

发芽势是反映种子品质的重要指标之一。一般认为发芽势高的种子播种后出苗整齐[27]。本试验研究结果两种独行菜种子发芽势随盐胁迫加重而降低，但NaCl溶液浓度在50～150 mmol·L-1范围内差异显著，在200～300 mmol·L-1范围内差异不显著，特别是宽叶独行菜种子发芽势均为零。这表明轻度盐浓度范围内，盐胁迫明显延缓了两种独行菜种子萌发时间，尤其是宽叶独行菜；而重度盐胁迫范围内，两种独行菜种子萌发差异不显著，特别宽叶独行菜发芽势均为零；这与Khan和何美香等人研究结果相一致[28-29]。

种子平均发芽速率和日相对发芽率是反应种子活力和发芽整齐度的指标。平均发芽速率大的种子生命力旺盛、播种后出苗早而整齐、着床种子发芽率高，日相对发芽率高的种子活力大[30]。本试验研究结果，腺独行菜种子发芽前期(1～4 d)，虽然盐胁迫程度加重种子发芽均受到抑制，但种子日均发芽率差异不显著，种子出苗率仍比较整齐、种子活力大；发芽中期(5～7 d)，轻度和中度(NaCl浓度50，100 mmol·L-1和150,200 mmol·L-1)盐胁迫下种子平均发芽率大于对照，随盐胁迫增加种子的活力增加，而重度盐胁迫(NaCl浓度250,300 mmol·L-1)种子萌发受严重抑制；发芽后期(7 d后)，NaCl浓度为50，150 mmol·L-1的腺独行菜种子发芽率相对对照CK大，浓度为250，300 mmol·L-1的种子发芽率相对对照CK小，这与Khan[24]和马彦军[15]等人的研究结果基本一致。而宽叶独行菜与腺独行菜不同，种子萌发随盐胁迫浓度增加而受到严重抑制，且高浓度盐胁迫完全抑制了种子的萌发，这与何美香等人[31]研究结果相一致。本试验结果，两种独行菜种子的日相对发芽率曲线均为双峰曲线。其中腺独行菜种子在轻度盐胁迫(NaCl浓度50,100 mmol·L-1)下，发芽时间与对照同步，中度盐胁迫(NaCl浓度150,200 mmol·L-1)下种子发芽日期出现滞后，重度(NaCl浓度250,300 mmol·L-1)盐胁迫下，发芽日期严重滞后甚至不再萌发。这与梁新华等人在研究干旱胁迫对甘草种子萌发时得出的结论[32]非常吻合，其研究认为在逆境胁迫下植物种子萌发出现发芽高峰期是种子内的过氧化氢酶在某个逆境胁迫条件下活性达到高峰期的结果[32]。

盐胁迫对种子萌发的抑制作用，主要通过渗透作用与离子毒害作用来实现[33]。由于植物种类的不同，盐胁迫下不同组织和器官的反应也不同[34]，有的植物盐胁迫下地上部抑制作用较地下部明显[35]，有的则地下部较地上部更敏感[36]。本研究结果，不同盐胁迫对两种独行菜种子胚芽的抑制作用均小于胚根的，且NaCl浓度150 mmol·L-1是两种独行菜种子胚芽和胚根生长受抑制作用的一个阈值。腺独行菜在盐胁迫为NaCl浓度150 mmol·L-1时显著促进胚芽的发育，之后随盐胁迫增大而胚芽生长受抑制作用也增大，但对胚根生长只有抑制作用没有促进作用；而宽叶独行菜则在这一胁迫浓度下胚芽、胚根均严重受到抑制作用。这与蔺吉祥[2]、Jeannette[35]和Croser[36]等人的研究结论。

4 结论

腺独行菜种子发芽率随NaCl浓度增加呈先升后降趋势，发芽势呈持续下降趋势；宽叶独行菜种子发芽率和发芽势均随NaCl浓度增加呈下降趋势，且NaCl浓度达150 mmol·L-1时完全失去发芽力。两种独行菜种子萌发均有两个峰值，轻度盐胁迫下第一峰值变小，第二峰值变大；中度盐胁迫下，两个峰值均变小，重度盐胁迫下，腺独行菜峰值变小滞后，而宽叶独行菜峰值为零。不同盐胁迫浓度与两种独行菜种子日相对发芽率均为负相关关系。不同盐胁迫对胚根生长的影响大于胚芽生长。总体而言，腺独行菜种子萌发耐盐性优于宽叶独行菜。