肝细胞癌早期复发灶的免疫微生态系统

樊 嘉

全世界每年新发肝细胞癌(简称肝癌)的病例中约一半发生在我国，因此，我国是“肝癌大国”。手术切除是目前最主要的肝癌根治性治疗方式，也是最有效的治疗方法。肝癌切除术后5年复发率高达70%，其中多数发生于手术后2年内(即早期复发)，严重影响了肝癌患者的长期生存和生活质量[1]。早期复发肝癌多由原发灶的肿瘤细胞在肝内播散形成，晚期复发肝癌则常起源于残余肝脏的新发病灶。相较于晚期复发，早期复发的肝癌进展更快，治疗效果不佳，患者预后更差。因此，揭示肝癌早期复发的机制，以此为基础探索早期复发肝癌综合防治的新策略，是进一步提高肝癌疗效和改善我国肝癌患者总体预后的关键课题。

越来越多的研究结果提示，肿瘤的发生和发展不是一个孤立事件，在肿瘤演进过程中，始终伴随着实质细胞与免疫微环境的相互作用。免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞，而肿瘤通过各种方式逃脱免疫监视，如降低免疫原性、诱导免疫耐受、促进免疫抑制、形成物理屏障。免疫治疗通过阻断肿瘤的免疫逃逸机制，恢复免疫细胞的杀伤功能，为治疗甚至治愈肿瘤提供了新思路。原发肝癌中的效应性CD8+胸腺依赖淋巴细胞(T细胞)较少，耗竭性CD8+T细胞占多数[2]。两项Ⅲ期临床试验的结果已表明，免疫检查点抑制剂单用(KEYNOTE-240临床试验)[3]或者联合使用抗血管生成药物(IMbrave150临床试验)[4]，均能使晚期肝癌患者获益，延长其生存时间。然而，从肿瘤最初形成到发生复发转移，免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用是动态变化的，不同时期肿瘤免疫逃逸机制可能并不相同[5]。早期复发肝癌与原发肝癌免疫微环境的差异，将会影响免疫治疗方式的选择。以下通过介绍早期复发肝癌的微环境特征，以及免疫细胞与肿瘤细胞相互作用的机制，以期为制订早期复发肝癌的免疫治疗新策略提供理论依据。

1 原发肝癌的非主要克隆更具复发优势

早期复发肝癌与原发肝癌同源，全外显子测序提示两者共有突变的比例为27%～49%，高于非同源肿瘤；单细胞DNA数据进一步揭示，早期复发灶的肿瘤细胞来源于原发灶的非主要克隆[6]。绝大多数患者的原发肝癌中至少有1个主要克隆，在配对复发灶中几近消失[7]。复发肝癌丢失原发肝癌的主要克隆是普遍现象。由于复发灶中的多数CD8+T细胞与原发灶中CD8+T细胞识别相同的抗原[6]，原发灶的非主要克隆可能因新抗原暴露少，不被CD8+T细胞识别而逃脱免疫清除，进一歩形成复发灶。因此，使用靶向新抗原的方法治疗早期复发肝癌时，不应遗漏更具复发优势的非主要克隆。

2 早期复发灶的肿瘤细胞逃逸免疫

原发灶肿瘤细胞增殖相关的信号通路呈活化状态，而复发灶肿瘤细胞则激活免疫监视和逃逸相关信号通路。在复发灶的肿瘤细胞中，免疫逃逸相关基因CD47基因的表达量增高，可能抑制树突状细胞(dendritic cell，DC)的成熟和抗原呈递，抵抗巨噬细胞的识别和吞噬，减少新抗原的释放；人类淋巴细胞抗原A、B、C的表达量增高，表明其对自然杀伤细胞介导细胞死亡的抵抗力增加。在免疫检查点配体基因中，原发灶和复发灶的肿瘤细胞低表达重组人半乳糖凝集素9[LGALS9，T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)的配体]、TNF受体超家族成员14[TNFRSF14，B和T细胞相关蛋白(BTLA)的配体]、程序性细胞死亡受体1配体2[PDCD1LG2，程序性细胞死亡受体1(PD-1)的配体]和含有V-Set结构域的T细胞激活抑制剂1[VTCN1，程序性细胞死亡1配体1(B7-H1)的配体]，高表达纤维蛋白原样蛋白1[FGL1，淋巴细胞激活基因3(LAG3)的配体]。此外，复发灶的肿瘤细胞中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、CD274[程序性细胞死亡受体1配体1(PD-L1)]表达量和CD274阳性细胞比例均高于原发灶。抗CD47的疗法或者多种免疫检查点抑制剂联合的疗法，可能有助于防治早期复发肝癌。

3 早期复发灶的CD8+T细胞多而失能

就浸润T细胞的所占比例而言，早期复发肝癌呈独特的免疫微环境特征，如CD8+T细胞比例增高，调节性T细胞(Treg)减少。此外，复发灶中增殖性和克隆扩增T细胞的比例降低亦提示免疫状态相对静止。

从免疫状态和细胞转变方面来看，原发灶与复发灶的CD8+T细胞的分化轨迹相同，但免疫状态和转录状态明显不同。相同的分化轨迹是指肿瘤内的浸润CD8+T细胞呈现出顺序变化的连贯状态，均存在早期状态、中间细胞毒性状态和终末耗竭性状态。不同的是，原发灶的CD8+T细胞多数处于中间细胞毒性状态和终末耗竭性状态，而复发灶的CD8+T细胞以早期状态为主，处于终末耗竭性状态者很少。复发灶中，早期状态CD8+T细胞的代谢依赖于脂肪酸氧化和有氧糖酵解，而不是氧化磷酸化，表明其能量代谢过程类似于记忆细胞，而不同于经典的幼稚细胞[8-9]。早期状态CD8+T细胞的CD45可变剪接更倾向于CD45RO而非CD45RA，也表明其并非幼稚状态，而是在先前已被激活。早期状态CD8+T细胞中上调的表达转录因子叉头蛋白1(FoxP1)，可使CD8+T细胞表现出无反应性特征，可介导TGF-β诱导的c-JUN蛋白转录抑制，维持记忆性T细胞的生存[10-11]。因此，复发肝癌中富集的CD8+T细胞呈记忆性和非杀伤状态。

相较于原发灶，早期复发灶中CD8+T细胞的组织驻留基因水平升高，抑制性和细胞毒性信号减弱，表明其处于低活化状态而非耗竭状态。复发灶中CD8+T细胞上调KLRB1(CD161)和IL受体(7IL7R)，表现出固有免疫样和记忆性T细胞表型[12]。杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)、自然细胞毒性触发受体3(NCR3)和RAR相关孤儿受体(RORA)的表达量增高，亦表明存在2型固有免疫样淋巴样细胞(ILC2)表型[13]。免疫组织化学检查证实，复发灶中CD161+CD8+T细胞富集，且与二次复发显著相关。细胞实验证实，CD161+CD8+T细胞的细胞毒性弱于CD8+CD161-T细胞。在KLRB1高表达CD8+T细胞中富集的基因集，能够提示肝癌患者预后不良。

与原发灶CD8+T细胞的衰竭状态不同，复发灶中以KLRB1过表达为特征的CD8+T细胞表现出固有免疫样、低细胞毒性和非耗竭表型。对于原发肝癌和复发肝癌，应考虑采用不同的免疫疗法。CD161+CD8+T细胞无法识别并攻击复发肿瘤，通过化学治疗或靶向治疗诱导复发肝癌释放新抗原，可能会激活未成熟的CD8+T细胞，引起复发肝癌特异性CD8+T细胞的克隆扩增。

4 早期复发灶DC抗原递呈受抑制

复发灶中DC的富集程度高于原发灶和复发灶癌旁组织，可以聚类为DC1[高表达包含9A的C型凝集素结构域(CLEC9A)]、DC2[高表达分化簇1C(CD1C)、含有10A的C型凝集素结构域(CLEC10A)]和DC3[高表达C-C基序趋化因子配体(CCL19)、溶酶体关联膜蛋白3(LAMP3)、C-C基序趋化因子受体(CCR7)]。DC2可向CD4+T细胞递呈特异性抗原，但无法向CD8+T细胞递呈。DC3细胞具有迁移至淋巴结的能力，可能是肿瘤特异性的DC亚群。在3个DC细胞亚群中，仅DC2在复发灶中显著富集。

DC细胞原本应发挥抗原递呈作用，增强适应性免疫。然而在复发灶中，肿瘤细胞可能通过PD-L1-CD80和CTLA4-CD80与DC(DC2或DC3)相互作用，竞争性抑制DC与T细胞CD80-CD28的相互作用(CD80对PD-L1和CTLA4的亲和力高于对CD28的亲和力[14])，进而抑制DC的抗原呈递作用，降低T细胞的活化效率，促进肿瘤细胞免疫逃逸。多重免疫荧光实验也证实，CD80+CD1c+DC位于PD-L1阳性复发肝癌细胞附近。除了直接作用，肝癌细胞还可释放PD-L1外泌体，进一步削弱抗肿瘤免疫[15]。恢复DC抗原递呈功能可能是治疗早期复发肝癌潜在有效的策略。

5 结 论

早期复发肝癌较原发肝癌有其独特的免疫微环境，其特征为免疫抑制细胞Treg的比例降低，DC细胞和固有免疫样CD161+CD8+T细胞的比例增高，T细胞的细胞毒性降低和功能失调。复发肝癌细胞与浸润免疫细胞间相互作用，促进了肿瘤细胞的免疫逃逸。多种免疫治疗联合使用是治疗早期复发肝癌最有效的策略，促进新抗原释放，阻断肿瘤细胞所致的免疫抑制，恢复CD8+T细胞的抗肿瘤作用，实现“1+1>2”治疗效果。合适的联合治疗策略、提示治疗效果的标志物，以及辅助治疗预防复发的价值，是肝癌免疫治疗领域需要关注的问题。