环境监测领域方法验证和确认探讨

田 瑜，刘志光，付 皓

(河南省安阳生态环境监测中心，河南 安阳 455000)

1 引言

随着科技的飞速发展，环境检测技术也在不断发展。生态环境部不断更新环境检测方法，环境检测机构为提高业务能力和扩大业务范围不断引入新的标准和检测方法。检测机构在使用标准方法或非标准方法时，应先对其进行方法验证或确认[1，2]。生态环境部和国家质量监督检验检疫总局发布了一系列的标准指导分析实验室开展方法验证或确认[3～5]。尽管如此，实验室在进行方法验证和确认时仍面临不少问题。本文主要探讨实验室如何开展方法验证和确认。

2 方法验证和确认的意义

实验室进行方法验证或确认目的是为了提供客观证据证明并保证实验室操作满足标准方法或非标准方法的要求，以及该标准方法或非标准方法可以满足实验室分析项目检测的需求。

3 方法验证和方法确认性能指标的选择

实验室在引入新标准方法时，首先要证明本实验室现有的设施设备、人员及技术能力、环境条件、试剂材料、标准物质等条件满足该标准方法要求，能够获得准确，可信、有效的检测结果。对标准方法性能指标的验证包括但不限于：校准曲线、检出限、准确度、精密度、空白试验、测定上限、测定下限等。

非标准方法在标准方法性能指标进行确认的基础上，增加了对方法的适用范围、干扰因素及消除方法等因素进行确认。 因此方法验证或确认的性能指标可根据实验室现有的技术条件、经济条件来确定，至少包括表1中选择的方法性能指标。

此外对于不确定度的测量，可根据实验室及相关需求确定是否需要测量不确定度。

4 方法性能指标验证和确认

4.1 检出限

经常被混淆的检出限概念是仪器检出限和方法检出限。仪器检出限是不考虑样品制备和前处理过程的影响，是仪器能够定性检测出待测物质的最低浓度或最小量,是区别于背景信号，仪器检测的最小可靠信号。通常用信噪比(S/N)表示，当(S/N)≥3时，定义为仪器检出限。由此可以看出仪器检出限与仪器的性能有关，用来衡量仪器是否满足实验要求。

方法检出限需要按照特定的分析方法的全部处理步骤处理样品和分析测定样品，在给定置信度内区别于空白试样的被检测出的最低浓度或最小量。由此可以看出仪器检出限要比方法检出限低。两者的区别在于是否考虑样品制备及前处理的影响。

确定方法检出限的意义在于，当待测物的浓度趋近于零时，该方法能否检出该物质。方法检出限的具体确定步骤及计算如下。

空白实验中检出目标物质。按照样品分析的全步骤，重复n≥7次空白试验。将各次结果换算为样品中的浓度或含量，计算n次平行测定的标准偏差，按照公式(1)计算检出限:

MDL=t(n-1,0.99)×S

(1)

式(1)中： t表示自由度为n-1，置信度为99%时t分布的单边临界值(单边t值)，可查有关的单边t值分布表获得；S表示n次平行测定的标准偏差。

如果空白试样中无目标物可加适量的目标物后，以空白加标的样品来测定。但是要满足：任意测定值之间可允许的偏差范围空白试验测定值的均值±1/2检出限。

通常关于水体的方法检出限按照上述确定即可，但是涉及土壤、沉积物、固体废物的检出限，实验室常常会面临该如何计算方法检出限。涉及土壤、沉积物或固体废物中的监测项目检出限的确定方法，一种是以实验用水加入适量的目标物质做空白实验，按照方法要求的前处理处理及测定后，再按照公式(1)计算出液态时检出限，然后转换成方法要求相应称样量、定容体积条件下的检出限。另一种对于土壤中重金属项目检出限用硅藻土做空白实验，测定土壤中监测项目的检出限；对于土壤中有机物项目采用石英砂做空白实验。

对于分光光度法，检出限以扣除空白值后与0.01吸光度相对应的浓度值为方法检出限。对于滴定分析中，一般以滴定管最小液滴体积计算，通常为以消耗0.02mL标准溶液所对应的浓度或者含量作为方法检出限。

计算出检出限后，实验室要对检出限进行评估，当实验室测定的检出限值小于或等于方法所规定的检出限时，说明该方法检出限满足要求。当实验室测定的检出限高于标准方法规定的检出限时，说明实验空白值不合格，存在干扰因素或试剂不合格。应找出原因，消除干扰后，重新测定直至小于等于方法规定检出限。

4.2 准确度

准确度常用于度量一个特定分析程序所获得的分析结果(单次测定值或重复测定值的均值)与假定的或公认的真值之间的符合程度。一个分析方法或分析系统的准确度是反应该方法或该测量系统存在的系统误差和随机误差的综合指标，它决定着这个分析结果的可靠性。

对于分析方法的准确度，可采用标准物质测量法或以标准物质做回收率测定的方法评价分析方法和测量系统的准确度。

(1)用标准物质测量法判定准确度。准确度用绝对误差或相对误差来表示。通常以重复分析标准物质，以测量值的平均值与真值的偏差做比较，测定结果要在置信区间内。

(2)用加标回收率测定法判定准确度。在样品中加入一定量的标准物质测定其回收率。回收率计算公式如下：

(2)

加标回收实验应注意几点：加标物的形态应该和待测物的形态相同；加标量应尽量与样品中待测物含量相等或相近，并应注意对样品容积的影响；当样品中待测物含量接近方法检出限时，加标量应控制在校准曲线的低浓度范围；当样品中待测物浓度高于校准曲线的中间点时，加标量应控制在待测物浓度的半量；在任何情况下加标量均不得大于待测物含量的3倍；加标后的测定值不应超出方法的测量上限的90%[6]。

4.3 精密度

精密度是使用特定的分析程序在受控条件下重复分析同一样品所得测定值之间的一致程度。它反映了分析方法或测量系统存在的随机误差的大小。精密度通常用极差、平均偏差和相对平均偏差、标准偏差和相对标准偏差表示。标准偏差在数理统计中属于无偏估计量而常被采用。精密度中包含重复性和再现性。在进行方法验证或确认时，尽可能覆盖到重复性和再现性。特别是再现性应尽可能地涵盖包括人员、环境、试剂、设施设备、技术能力、其他可能存在的不可控因素等的影响。

由于分析结果的精密度与待测物质的浓度水平及实验条件有关，通常所做的精密度测试结果分别选用测量范围内的低浓度，中等浓度和高浓度三种梯度的浓度样品进行测定。此外由于标准偏差受次数的影响，因此最少测定6次。

4.4 校准曲线

校准曲线至少有6个浓度点(包括校准零点)。其浓度范围应覆盖待测物质的主要分布范围。最低浓度点一般选在定量限附近，中间点尽量为待测物质平均浓度范围。每个浓度点最少测量两次。相关系数应符合相应的要求。

此外绘制标准曲线时应注意：应在分析样品的同时绘制工作曲线，并要达到质量要求；校准曲线不能相互借用；应使用校准曲线浓度范围之内的直线部分，不得将校准曲线在高浓度端外推或在低浓度端顺延使用。

4.5 适用范围

适用范围指方法适用的环境监测要素和监测项目。如方法适用环境要素是降雨、废水、土壤、沉积物、固体废物和环境空气等。监测项目如：锌、镍、氨氮、空气中的VOCS、降尘等。

对于非标准方法的确认要说明适用环境要素、监测项目、适用浓度范围。必要时还需确认不适用的范围。

4.6 实际样品分析

实验室开展方法验证或确认应包括对实际样品的分析检测，目的是检验该方法在实际样品中的应用，并且发现在实际样品分析中可能出现的干扰因素，同时针对实际样品可能出现的干扰因素，进行干扰因素消除实验。以确保所验证的标准方法可用于实际样品的分析。

4.7 干扰因素及消除

对于非标准方法的确认，必须进行干扰因素及消除实验，以便更好适用实验室检测需求。一般要对试剂基质、标准溶液基质、不含或含待测物质接近零的样品基质进行干扰因素测定，以及在上述基质中加入可能的干扰因子进行测定，并采取有效措施，消除干扰。针对可能存在的共存物质，要做干扰实验，检验其是否存在干扰，采取措施消除干扰，并了解共存物质最大允许浓度。干扰实验选择两个或多个待测物质浓度和不同浓度水平的共存物进行实验测定。

常见的消除干扰的方法有加入基体改进剂、消电离剂、保护剂、掩蔽剂、化学预分离等，标准加入法在一定程度上也能消除干扰。

5 异常值判断

在进行方法验证或确认时，出现异常值是常见的问题，但是如何判断一组数据中是某个或某几个数据是否是异常值，常常令人疑惑。在环境检测中判断异常值[7]的方法常用的有Grubbs检验法、Dixon检验法、Cochran检验法、偏峰度法等。本文主要介绍Grubbs检验法和Dixon检验法[7]。

Grubbs检验法用于一组测量值的一致性和剔除一组测量值中异常值，该检验法一次只能检出一个异常值。具体计算公式见公式4。

(3)

(4)

由公式(4)计算得出第i个数(Xi)的Gi值，通过查表得到在规定检验水平α所对应的G值，一般指定检验水平α为5%、1%或10%。如果Gi值小于该G值则说明Xi不是异常值，否则Xi属于异常值，应该剔除。

Dixon检验法用于一组测定值的一致性检验和剔除一组测定值中的异常值，该检验方法可用于检出一个或多个异常值。

首先将一组数据按大小顺序排列：X1

(5)

(6)

通过查表得到在规定检验水平α所对应的D值，当计算得到的高端异常值小于查表所得的D值时，则无异常值，否则Xn为异常值；计算所得低端异常值小于查表所得的D值时，则无异常值，否则X1为异常值。

当出现异常值时，要重视异常值给出的信息，判断是否存在系统偏差，及时找出原因，排除干扰。

6 结论

进行标准方法验证和非标准方法的确认是环境检测工作的重要内容之一,是保证环境监测数据质量的第一步，同时也是实验室取得资质的重要组成。只有经过验证的标准方法或确认的非标准方法才能确定满足实验室检测需求，保障实验室技术能力；才能保证数据的准确性、可靠性、有效性及科学性。