SGLT2抑制剂对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤及PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响*

祝再然, 张明, 赵桂金, 董嘉良

天津市宁河区医院 1内分泌科, 2检验科(天津 301500)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者的常见并发症，约有40%的糖尿病患者均伴有不同程度的慢性肾脏疾病[1]，这类患者如果不能得到及时的诊断和治疗，有可能导致肾脏功能衰竭，甚至死亡。目前DN尚无根治之法，临床主要是控制血糖，延缓肾病进程为主。钠-葡萄糖协同转运蛋白(sodium-dependent glucose transporters，SGLT) 2 抑制剂是一类新型的口服降糖药，SGLT2 抑制剂除了能降血糖以外，还具有肾脏保护作用。达格列净是一种SGLT2 抑制剂，于2017 年3 月在中国获批上市[2]，但国内上市的时间较短，临床应用经验有限。DN的发病机制尚不完全清楚，足细胞附着于肾小球基底，是肾小球血液滤过的重要组成部分，近年来研究[3]发现足细胞损伤是DN的病理基础之一，被认为是引起尿蛋白的关键原因。磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路是参与体内细胞分化、增殖和凋亡的主要通路。基础研究[4]表明高糖环境会通过PI3K/Akt通路引发足细胞损伤。第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是PI3K /Akt的上游调控基因，能通过磷酸化/去磷酸化调节该通路活性[5]。2018年1月至2019年8月，本研究旨在通过研究SGLT2 抑制剂对DN大鼠足细胞损伤的影响以及PTEN/PI3K/Akt通路的影响，来探讨其保护肾脏功能的机制，以期为临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 实验动物为40只SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g，动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证编号：SCXK(湘)2010-000。实验前在12 h日夜交替、(24±2)℃，相对湿度60%环境下适应性培养1周。链尿佐菌素(STZ，Sigma公司)，p-PI3K多克隆抗体、兔抗鼠P-Akt(ser-473)多克隆抗体、兔抗鼠PTEN多克隆抗体试剂盒购自武汉博士德生物技术，Western blot一抗/二抗稀释液购自上海哈灵生物科技有限公司。慧达HD-310A/HD-310B生物组织包埋机，KD-202-VI冷冻切片机，迈瑞全自动生化分析仪(BS180)，上海彼爱姆 BM-57XCS光学显微镜，及日立透射电子显微镜(H-7650)。

1.2 实验方法

1.2.1 DN模型建立[6]和给药 SD大鼠适应性培养1周后进行造模，36只大鼠随机分为对照组(12只)、模型组(12只)和实验组(12只)，其中模型组和实验组进行DN造模：通过尾静脉以60 mg/kg的剂量一次性注射1% STZ溶液(使用pH=4.2柠檬酸缓冲液溶解)，对照组注射等量生理盐水；72 h后使用尾部静脉针取血检测空腹血糖，以血糖浓度>16.7 mmol/L为造模成功。本次造模全部成功。实验组每天早晨9点进行1 mg/(kg·d)达格列净灌胃，对照组和模型组灌胃等量生理盐水，连续灌胃8周。试验期间所有大鼠进行正常饮食和自由饮水，试验期间每2周进行1次空腹血糖监测，剔除空腹血糖<16.7 mmol/L的样本，本研究试验期间未发生剔除样本。

1.2.2 生化指标检测 第8周给药结束后禁食12 h，期间自由饮水；采用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，测定24 h尿蛋白排泄率，并测量空腹血糖；使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，收集腹部主动脉血液，并分离双侧肾脏，肾脏在生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，计算肾脏指数，肾脏指数=双侧肾脏质量/大鼠体质量×100%。肾脏组织称重后-80℃冷冻备用。主动脉血液3 500 r/min离心10 min取上清液，采用全自动生化检测仪检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.2.3 肾组织病理学检测 取肾脏组织酒精梯度脱水石蜡包埋切片，进行HE染色：组织切片脱蜡脱水后加入苏木精染色1～2 min，水洗10 s后，加入1%盐酸乙醇，3 s后水洗，加入促蓝液返蓝10 s，流水冲洗2 s，加入1%伊红1～2 min，流水冲洗2 s，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，树胶封固，光学显微镜镜检。

1.2.4 足细胞观察 取肾组织标本，切成1 mm×1 mm×1 mm小块，立即使用3.75%戊二醛固定4 h，PBS缓冲液冲洗，乙醇梯度脱水，包埋后切片机切片(80～90 mm厚度)，枸橼酸铅电子染色，采用透射电镜镜检。

1.2.5 PTEN、p-PI3K、Akt蛋白表达 采用Western blot蛋白印迹法测定肾脏组织中PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表达，取50 mg 1.2.2中肾脏组织使用匀浆研磨在液氮中研磨打碎，加入1 mL细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上操作提取总蛋白，使用BCA 法测定蛋白浓度，上样量20 μg，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，转膜，加入0.5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗鼠PTEN多克隆抗体、兔抗鼠p-P13K多克隆抗体、兔抗鼠p-Akt多克隆抗体、β-actin)，过夜，洗膜，加入1∶1 000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1 h，采用电化学发光发进行显影，采用Image Lab软件分析蛋白条件的灰度值，蛋白相对表达量用目的蛋白的灰度值与β-actin的比值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，计量资料采用均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生化指标结果 建模成功后给药前，模型组和实验组空腹血糖差异无统计学意义(P>0.05)，但显著高于对照组(P<0.05)，给药8周后模型组空腹血糖显著高于实验组，实验组显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。给药8周后，血清Scr、血清BUN、肾脏指数、24 h尿蛋白排泄率均为：模型组>实验组>对照组，组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠行生化指标结果比较

2.2 肾脏组织和足细胞检测和结果 光学显微镜下肾脏组织HE染色结果可见：对照组大鼠肾小球形状完整，结构清晰，未发生基质增生，基底膜增厚，未见纤维组织；模型组大鼠和实验组大鼠肾脏结构可见不同程度基质增生增厚，基底膜增厚，系膜扩张，其中实验组大鼠与模型组比较肾脏组织可见改善。见图1。

A：对照组；B：模型组；C：实验组

电子显微镜下足细胞的超微结构可见：对照组毛细血管基底膜形态正常，未发生基底膜增生，足细胞形状规则，排列整齐；模型组可见基底膜增厚，内部出现沉积物，足细胞发生足突融合，排列混乱，裂空减少，线粒体数量减少、嵴断裂，伴有空泡变性；实验组基底膜也发生增厚，但程度轻于模型组，足细胞可见部分足突融合，排列较模型组整齐，整体情况与模型组比较可见改善。见图2。

A：对照组；B：模型组；C：实验组

2.3 p-P13K、p-Akt、PTEN表达情况 Western blot结果表明p-PI3K、p-Akt蛋白表达：模型组>实验组>对照组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，PTEN蛋白表达：模型组<实验组<对照组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2和图3。

表2 3组大鼠p-PI3K、p-Akt、PTEN蛋白相对表达比较

图3 3组大鼠肾脏组织p-P13K、p-Akt、PTEN 蛋白Western blot检测结果

3 讨论

DN是2型糖尿病常见并发症，是引起肾功能衰竭的重要原因，也是导致糖尿病患者死亡的原因之一。其临床病理改变为肾小球基底膜增厚、系膜增生，临床症状主要为肾功能衰退和出现尿蛋白[7]。DN发病机制复杂，目前存在血流动力学异常、氧化应激、炎症反应、糖代谢紊乱等多种相关假说，但单一假说尚无法完全阐释DN的发病过程。近年来随着研究深入，足细胞和PI3K/Akt信号转导通路机制在DN的发病和发展中受到越来越广泛的认可，被认为与血糖的稳定型和尿蛋白形成密切相关。SGLT2抑制剂是一种新型降糖药，被美国食品药品监督管理局和欧洲药物管理局推荐为一线降糖药物的替换选择，并有研究发现其有独立于降糖作用的肾脏保护作用[8]。

达格列净是一种代表性SGLT2 抑制剂，于2017 年3 月在中国获批上市，该药在国内上市的时间较短，临床应用经验有限。因此本研究通过建立DN模型，来研究达格列净的降糖作用和肾脏保护作用。结果发现达格列净干预的实验组大鼠的空腹血糖、血清Scr、血清BUN、肾脏指数、24 h尿蛋白排泄率均显著低于模型组，但仍然显著高于对照组，生化指标结果说明在一定程度上达格列净可以降低血糖，减轻尿蛋白。为了探究达格列净对肾脏功能的保护作用，本研究进一步对肾脏组织和足细胞的功能形态进行了镜检，结果发现在光学显微镜下可见实验组基质增生增厚、基底膜增厚、系膜扩张程度轻于模型组，电子显微镜下可见底膜增厚、足细胞足突融合以及足细胞排列状态相对于模型组有明显改善，说明达格列净的干预对肾脏病理损伤和足细胞损伤有改善作用。足细胞是一种无增生能力的高度分化细胞，足细胞损伤的表现为足突发生融合甚至消失、排列紊乱、体积变小，最终从肾小球上脱落进入尿液，足细胞发生损伤脱落后，滤过膜的完整性遭到破坏，滤过作用下降，形成尿蛋白[9]。一项Meta分析[10]表明SGLT2抑制剂能显著改善血糖和中度肾功能损害。分析认为持续高血糖是引起足细胞损伤的原因之一，一方面达格列净的降血糖作用可以减轻高血糖对肾脏足细胞的损伤；另一方面达格列净可以特异性地抑制肾小管SGLT2的表达，增加对钠离子的重吸收，增加肾脏血流量，减轻肾小球内压，改善DN早期的肾小球高滤过状态，有利于保护滤过膜的完整性[11]。

PI3K/Akt 信号通路通过磷酸化作用被激活生成p-PI3K/p-Akt，其表达与DN的发生发展密切相关，PTEN是PI3K/Akt 信号通路活化的上游抑制因子，Lin等[12]报道PTEN的丢失会加重足细胞损伤。因此基于前期的生化指标和足细胞镜检结果，本研究进一步检测了上述蛋白在达格列净干预的DN模型大鼠肾脏中的表达。Western blot结果发现，实验组p-PI3K、p-Akt蛋白低于模型组并高于对照组，PTEN蛋白表达高于模型组并低于对照组。李翠凡等[13]研究发现DN患者存在p-PI3K与p-AKT过度激活现象，PTEN蛋白是一种具有特异磷酸酯酶活性的酶，可以通过脱磷酸作用抑制PI3K活化，即PTEN蛋白的表达可以抑制p-PI3K/p-Akt的活性[14]。同时有研究[15]报道，激活后的PI3K/Akt信号通路会介导足细胞损伤，引起蛋白尿。陈玲等[16]发现达格列净能调节DN大鼠的尿浓缩功能，并且能影响肾组织与重吸收相关的转运蛋白的表达。晚期糖基化终产物(AGEs)的累积会激活PI3K与AKT，达格列净可能是通过控制血糖降低PI3K/Akt的激活，也可能是通过独立的肾脏保护作用上调PTEN蛋白表达，抑制PI3K/Akt 的磷酸化作用来调节下游蛋白表达改善足细胞损伤、保护肾脏功能的机制[17]。

本研究虽然通过光学显微镜和电子显微镜观察到SGLT2抑制剂对DN大鼠的肾脏组织和足细胞损伤具有一定的改善作用，且发现SGLT2抑制剂干预后PI3K/Akt的活化以及下游PTEN蛋白的表达发生变化，但是对于其影响PI3K/Akt/PTEN的具体机制尚不得知，这也将是我们未来的研究方向。综上所述，达格列净能降低DN大鼠的血糖水平，减少尿蛋白，改善肾功能和足细胞损伤，可能与其上调PTEN蛋白，下调p-PI3K/p-Akt表达有关。