HPLC 法同时测定风寒感冒颗粒中6 种成分

林海霞,代俊萍

(1.乐山市食品药品检验检测中心,四川 乐山 614000;2.乐山市中医医院,四川 乐山 614000)

风寒感冒颗粒是由葛根、防风、甘草、陈皮等11 味药材制成的中成药,具有解表发汗、疏风散寒的功效,用于治疗风寒感冒、发热、头痛、恶寒、无汗[1],该制剂收载于卫生部颁布标准中药成方制剂第1 册(WS3-B-0045-89),但其质量标准中尚无定量测定方法,而且文献[2-8]也仅涉及其中1～2 种成分。中药制剂成分复杂,采用多成分分析以全面评价其内在质量已成为一种趋势[9-11]。

研究表明,葛根素具有抗炎、抗氧化等作用[12],升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷具有解热、镇痛、抗炎、抗菌等作用[13],甘草苷、甘草酸铵具有抗氧化、抗炎等作用[14-15],橙皮苷具有抗炎、抗过敏、抗氧化、抗自由基等作用[16]。因此,本实验建立HPLC 法同时测定风寒感冒颗粒中葛根所含葛根素,防风所含升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷,甘草所含甘草苷、甘草酸铵,陈皮所含橙皮苷的含有量,以期更好地控制该制剂质量。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 型HPLC 色谱仪(美国Agilent 公司)；CQ-100B 型超声波清洗器(250 W、50 kHz,上海跃进医用光学器械厂)；XS205DU 型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司]；ULUP-11-10 超纯水机(成都超纯水科技有限公司)。

1.2 试剂与药物 6 批风寒感冒颗粒(8 g/袋)购于云南白药集团股份有限公司(批号ZLA1812、ZHA1906)、贵州百灵企业集团制药股份有限公司(批号A20181221、A20190634)、修正吉林长白山药业集团股份有限公司(批号181134、181005)。葛根素(批号110752-201816,纯度95.4%)、升麻素苷(批号111522-201209,纯度93.7%)、甘草苷(批号111610-201607,纯度93.1%)、橙皮苷(批号110721-201617,纯度96.1%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号111523-201509,纯度95.8%)、甘草酸铵对照品 (批号110731-201619,纯度93.0%) 对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 JADE-PAK ODS-AQ C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相甲醇(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0～20 min,25%～35% A；20～27 min,35% A；27～45 min,35%～50% A；45～70 min,50%～95% A)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长237 nm (甘草酸铵)、250 nm (葛根素)、254 nm (升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷)、276 nm (甘草苷)、283 nm (橙皮苷)；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量,分别加甲醇制成含葛根素1.803 0 mg/mL、升麻素苷0.417 9 mg/mL、甘草苷0.192 7 mg/mL、橙皮苷0.304 8 mg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.423 4 mg/mL、甘草酸铵0.112 7 mg/mL 的贮备液,分别精 密吸取0.8、0.5、0.3、2.0、1.0、3.0 mL,置于同一10 mL 量瓶中,甲醇定容,摇匀,即得(各成分质量浓度分别为144.2、20.89、5.781、60.96、42.34、33.81 μg/mL)。

2.3 供试品溶液制备 取颗粒适量,研细,取细粉约3 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,70%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.4 阴性样品溶液 按颗粒处方比例和制备工艺,分别制备缺葛根、缺防风、缺甘草、缺陈皮的阴性样品,按“2.3” 项下方法制备,即得。

2.5 系统适用性与专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,各成分均达到基线分离,分离度均大于1.5,阴性无干扰,表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC charomatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密量取“2.2” 项下贮备液,70%甲醇稀释成5 个质量浓度,各精密吸取10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次,测得葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵峰面积RSD 分别为 0.05%、0.45%、0.75%、0.38%、0.56%、0.36%,表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一份“2.3” 项下供试品溶液,室温下分别于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵峰面积RSD 分别为0.24%、0.96%、0.89%、0.34%、0.48%、0.55%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批颗粒(批号ZLA1812)6 份,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵含有量RSD 分别为0.78%、1.01%、1.35%、0.45%、1.08%、1.05%,表明该方法重复性良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.10 加样回收率试验 精密称取各成分含有量已知的同一批颗粒(批号ZLA1812) 1.5 g,共6 份,加入1.803 0 mg/mL 葛根素对照品溶液1.7 mL、0.417 9 mg/mL 升麻素苷对照品溶液0.4 mL、0.192 7 mg/mL 甘草苷对照品溶液0.8 mL、0.304 8 mg/mL 橙皮苷对照品溶液 3.8 mL、0.423 4 mg/mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液2.0 mL、0.112 7 mg/mL 甘草酸铵对照品溶液10.0 mL,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵平均加样回收率分别为100.45%、94.36%、92.25%、99.74%、93.25%、93.05%,RSD 分别为 1.02%、1.14%、1.74%、1.26%、1.35%、1.41%。

2.11 样品含有量测定 取6 批颗粒,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,外标法计算含有量,结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg/g，n=3）

3 讨论

本实验考察了不同提取方式(超声、回流),提取溶剂(甲醇、70% 甲醇、70% 乙醇、无水乙醇)、提取时间(15、30、60 min),发现70% 甲醇超声提取30 min 时出峰率、峰面积最理想,而且无杂质干扰。再采用二极管阵列检测器,在200～400 nm 波长处进行紫外吸收扫描,为了保证各成分均有适宜的灵敏度、分离度、丰度并无干扰,最终选择波长切换模式。结果显示,不同厂家、批次风寒感冒颗粒中6 种成分含有量均存在一定差异,可能与制剂生产工艺及投料有关,故厂家不仅要按标准工艺操作,还应严格控制原料药质量,这样才能保证成药质量稳定、安全有效。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定风寒感冒颗粒中葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵的含有量,该方法操作简便,准确性、重复性良好,可用于该制剂的质量控制。