FOXO1影响胰岛β细胞去分化作用机制研究＊

李盼盼，代 培，苏 通，丁 雷，董笑克，郭翔宇

（北京中医药大学东方医院 北京 100078）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是全世界最主要的慢性非传染性疾病之一，2013年的流行病学调查结果显示，我国DM 患病率为10.4%[1]。在最近发表的4C研究（China Cardiometabolic Disease and Cancer Cohort Study）中发现，欧美人2 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）的最重要的发病机制是胰岛素抵抗，而中国人则是在β细胞功能缺陷的基础上合并胰岛素抵抗[2]。以往认为导致β细胞功能缺陷的主要的原因是细胞凋亡，近年来研究表明β细胞去分化才是β细胞功能缺陷的主要原因。叉头框转录因子（FOXO1）是参与β细胞增值、凋亡、分化的关键核转录子，大量的实验证明FOXO1 与β细胞去分化有着密切的关系，但对于FOXO1 参与β细胞去分化的具体机制以及抑制和逆转β细胞去分化的干预措施方面，尚缺乏系统的整理和论述，本文就FOXO1 影响β细胞去分化的作用机制，及抑制和逆转β细胞去分化的干预措施做一系统综述。

1 β细胞的增殖凋亡与去分化

胰腺是由α细胞、β细胞、生长抑素细胞以及少量的PP 细胞构成的，其中最主要的细胞是β细胞，体内唯一能够降低血糖的胰岛素正是由β细胞分泌的[3]。β细胞最初是从多功能祖细胞分化来的，其生长速度在胚胎后期和新生儿时期是最高的，然后逐渐下降到成年期，婴儿时期的β细胞增殖的调节对成人时期的β细胞的质量至关重要[4]。

β细胞的功能缺陷或衰竭在2 型糖尿病患者明确诊断时，甚至在糖尿病的早期阶段就已经发生了，随着疾病的进展，衰竭的程度不断加剧。过去认为，β细胞功能衰竭的机制是细胞凋亡，主要为糖毒性、脂毒性以及淀粉样变性[5]。糖毒性使得β细胞内的葡萄糖超出了β细胞的糖酵解的能力，造成氧化损伤；脂毒性状态下，饱和游离脂肪酸刺激炎症通路，引起氧化损伤和内质网应激，导致β细胞的功能障碍[6,7]。尸检发现90%以上的T2DM都存在胰岛的淀粉样变性[8]，细胞的RNA 和功能蛋白的生成都会受到其变性物质的损伤，造成细胞核的固缩，DNA 链的断裂，细胞质表层发生水泡样突起，最终诱导β细胞的凋亡[9]。

最近大量的研究表明，糖尿病患者的β细胞更多的是经历了一个“去分化”的过程，而不是细胞凋亡[10]。胰岛β细胞的去分化是指β细胞基因蛋白层面发生变化，导致细胞的表型发生改变，使得已经分化为具有正常功能的β细胞出现了逆生长趋势，失去其作为成熟β细胞的标志物，部分或者完全无法分泌胰岛素，表现为祖细胞标志物增多，并且去分化的β细胞或可能转化为胰岛的其他细胞。β细胞去分化作为胰岛β细胞障碍的新机制是从1999年开始逐渐被认识的。2004年，有研究者在体外胰岛细胞实验中发现了β细胞的上皮细胞在实验过程中向间充质细胞转变的现象[11]；在2008年，有研究者发现在尸供者的胰腺标本中，与匹配的对照组（包括但不限于年龄、性别等）相比，被诊断为T2DM 患者的β细胞质量减少了约50%，而少量的凋亡的β细胞并不能完全解释这种现象[12]；2012年，Talchai 等[13]报道了β细胞去分化是β细胞功能衰竭的机制之一；之后在2017年，Wang 等[14]通过总结得出导致T2DM 患者β细胞功能障碍和胰岛素分泌不足的主要机制是β细胞的去分化，而不是细胞凋亡。

2 FOXO1对β细胞去分化的影响

叉头框转录因子是一组蛋白家族，其特征是翼状的DNA 结合区，FOX 作为这组转录因子的表示符号是在2000年才被采用的[15]。FOX 家族的共有特点是FOX 的结构域，由100 个左右的氨基酸构成，拥有3 个α螺旋以及2 个翅膀状的环状结构。FOX 转录因子一共有17 个亚家族，其中FOXO 是O 亚族，FOXO 有5 个氨基酸嵌入到第2和第3个α螺旋中，这是它区别于其余 亚 家 族 的 关 键。FOXO1、FOXO3a、FOXO4 以 及FOXO6 是人体中的4 个FOXO 的共同起源基因，FOXO1 是其中被最早发现的一员。胰腺及具有其效应的靶细胞是FOXO1 最重要的表达场所，包括肝细胞、肌肉细胞、脂肪细胞。需要注意的是，虽然其在胚胎阶段表达于全部胰腺，但它在成年胰腺中仅表达于β细胞中。

许多研究报告称，FOXO1的转录活性受到翻译后修饰的调节，如磷酸化、乙酰化以及泛素化。基于磷酸化和乙酰化的作用，FOXO1可以在细胞核质之中游走[16]。FOXO1 磷酸化是通过胰岛素等作用于胰岛素受体，受体底物进一步激活PI3K/AKT 通路，诱使AKT磷酸化而实现的，FOXO1 的磷酸化能够加快FOXO1的核输出，使得其核定位受到阻碍，阻止FOXO1 蛋白重新返回细胞核内，这一过程使得FOXO1在胰岛素信号转导中起负性调节作用；P300，CBP等相关因子可以使FOXO1 乙酰化，而组蛋白去乙酰基酶（Histone deacetylase，HDAC）可以使FOXO1 去乙酰化，FOXO1乙酰化可以减慢FOXO1 和DNA 的转录，使得FOXO1对AKT 的磷酸化更加敏感，以此来调节转录活性[17]；泛素化可以降解大部分的蛋白，FOXO1的泛素化可以使其通过蛋白酶体发生降解，缩短FOXO1蛋白的半衰期，保持其蛋白水平的稳定性[18]。

除FOXO1 外，影响和调控T2DM 中的β细胞分化和功能损害的转录因子还包括胰岛胰腺十二指肠同源盒1（Pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1）、RFX6 转 录 因 子、NKX6 转 录 因 子 相 关1（NK6 transcription factor related, locus 1，NKX6.1）和肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系 A（Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A，MafA）等。这些转录因子之间存在着密切的联系，其中FOXO1在成人胰腺β细胞中最显著的作用就是对PDX1 的负转录调节[19]。PDX1 既可以促进β细胞增殖，又可以通过增加抗凋亡蛋白和减弱凋亡蛋白的活性来抑制β细胞的凋亡。PDX1 对胰岛素具有调节作用，主要是通过与胰岛素基因上的特定区域的转录因子结合而发挥的，除此之外，PDX1 还可以通过与葡萄糖转运体（Glucose transporter 2，GLUT2）和葡萄糖激酶（Glucokinase，GK）结合、调节β细胞的线粒体和胰淀素等途径来影响胰岛素的分泌[20]。PDX1的表达受FOXO1的控制，β细胞中FOXO1 过表达导致PDX1 转录减少，从而导致机体胰岛素分泌缺陷。相反，FOXO1的单倍剂量不足会恢复β细胞中PDX1 的表达，维持β细胞功能[21]。并且由于FOXO1 和PDX1 在细胞核内共定位，所以两者在核定位上存在着互斥关系，FOXO1 位于PDX1 阳性β细胞的细胞浆中，而位于PDX1 阴性β细胞的细胞核中[22]。Yu等[23]在体外实验中观察FOXO1和PDX1的表达和定位，发现使用了FOXO1 的选择性抑制剂AS1842856 处理后，PDX1 出现在细胞核内，而FOXO1出现在人类胚胎干细胞来源的胰腺祖细胞的细胞质内。同时还发现FOXO1 基因敲除可上调胰腺β细胞分化相关转录因子和标记物NKX6.1、PDX1、胰岛素、GK和GlUT2的表达水平。

当糖代谢异常时，各种炎性因子，如氧化应激活性氧族（Reactive oxygen species，ROS）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等都被释放入血，胰岛素正常的信号通道受阻，使得FOXO1 不能正常磷酸化，可以在细胞核内观察到大量的FOXO1 蛋白。血糖升高的早期，胞核内代偿性增加的FOXO1能够使得胰岛素基因启动子（IPF-1/PDX-1）与增强子区的转录因子的结合增强，促进β细胞的增殖和分化，进而胰岛素会代偿性地升高[24]。但当血糖进一步升高，高糖状态导致的氧化应激持续造成损伤，经mRNA 翻译的胰岛素在内质网不断地被折叠和修饰，形成新的胰岛素元和分子伴侣，未折叠蛋白的不断增加会形成未折叠蛋白效应，这种情况会造成FOXO1 的数目下降，活性消失，FOXO1 失代偿，不能继续发挥促进β细胞增殖分化的作用[25]，表现为NKX6.1 等成熟β细胞的标志物的数目减少，最终导致胰岛β细胞去分化[26]。

Kobayashi等[27]发现敲除了FOXO1的db/db小鼠糖耐量实验结果异常的概率更大，从而推断其可能的原因 是β细 胞 缺 乏FOXO1 的 保 护。Kim-Muller 等[24]在T2DM 患者胰腺的体外研究中观察到虽然胰岛β细胞数量有所减少但与功能减退程度不成比例，且胰岛β细胞去分化伴有显著FOXO1 降低。刘婵等[28]等通过培养小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞，发现高浓度葡萄糖（35 mL）干预48 h 能下调MafA、PDX1、INS-1 基因在MIN6 细胞中的表达，并且观察到高糖可以抑制MIN6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的功能以及阻碍FOXO1磷酸化的过程，从而得出高糖状态可能经由FOXO1的作用导致β细胞的去分化。

有研究者在免疫荧光标记的实验中观察到，中等升高的血糖会导致db/db 小鼠的β细胞胰岛素免疫荧光降低大概15%-45%，而重度升高的血糖则会造成β细胞的胰岛素免疫荧光仅有15%，且能观察到“空巢”样变[29]。当高糖导致β细胞去分化后，能在β细胞中观察到大量的内分泌祖细胞标志物，如前内分泌标记物神经生长素3（Neurogenin 3，Ngn3），以及多能标记物，如Oct4、Nanog 和L-Myc 等。Talchai 等[13]在实验中使用了敲除FOXO1 的小鼠，发现在基础条件下，这些小鼠和对照小鼠代谢没有差别。然而应激条件下（如多次分娩或衰老），敲除FOXO1的小鼠血糖升高，胰岛素分泌减少、β细胞的数量减少30%，α细胞数目增加50%，胰高血糖素分泌增加。通过进一步的永久标记发现，小鼠胰腺不再表达PDX-1、MafA和胰岛素，而是像它的原始细胞一样表达Ngn3，以及间充质干细胞如Nanog 等，通过谱系追踪研究发现，在这些小鼠中，一些α细胞是从以前的去分化β细胞中产生的。上述实验证实了FOXO1 的功能缺陷可以诱导小鼠β细胞发生去分化，使得成熟β细胞去分化为多能状态，具有向胰腺α细胞、ð细胞和PP细胞多种方向分化的能力[30]。

3 抑制和逆转β细胞去分化的干预措施

尽可能地抑制和逆转β细胞的去分化对于糖尿病患者的远期愈后是极其重要的。生活方式以及饮食的控制可以抑制及逆转2 型糖尿病患者β细胞去分化，White 等[31]观察到早期2 型糖尿病患者在减肥后，成熟β细胞标记物如胰岛素、PDX1 和MafA 水平显著增加，说明减肥可能逆转β细胞的去分化，甚至诱导β细胞再分化，从而逆转糖尿病发展的进程。邹潇等[32]在试验中使用了普通饮食的小鼠作为正常组，另设高脂饮食组小鼠，和高脂饮食+苯扎贝特组小鼠，发现相较于普通饮食组，高脂饮食组胰岛β细胞中的Nanog增多，胰岛素和FOXO1 减少，且FOXO1 向细胞核发生转移，而苯扎贝特治疗组胰岛素及FOXO1 表达恢复，且Nanog 的数目下降，证实苯扎贝特能够使得高脂状态导致的β细胞去分化得到改观。Ishida 等[33]发现与随意喂养的db/db 小鼠相比，进食量减半喂养的db/db小鼠的胰岛中的β细胞数增加（56%-68%，P=0.01），而α细胞数则没有变化（2%-4%），β细胞标记物如胰岛素、FOXO1、MafA 被恢复，去分化标记物乙醛脱氢酶la3（ALDH la3）被抑制，表明饮食限制可以防止并可能逆转β细胞的去分化。尽管大量的证据能够表明减肥和饮食控制等生活方式，可以改善和逆转β细胞的去分化，然而，研究证实在糖尿病的晚期阶段，单纯节食作为一种治疗方法不再有效，通过饮食控制来逆转β细胞功能障碍似乎仅限于疾病的最初10年[34]。

在药物治疗中，Wang 等[35]在一项动物实验中发现使用胰岛素可以使得已经发生去分化的β细胞再次分化为具有正常功能的β细胞，他们通过将严重糖尿病的KATP-GOF 小鼠（血糖＞500 mg·dL-1，持续约3 周）分为了2组，即未治疗组和长期胰岛素治疗组，发现治疗组在经胰岛素治疗后再分化为具有生成胰岛素功能的β细胞，β细胞标志物PDX1、mRNA、NKX6.1 以及MafA 的表达恢复到正常水平，同时祖细胞标志物Ngn3、Oct4、Nanog 和L-Myc 减少，证明了使用胰岛素可以逆转β细胞的去分化，Weng 等人[36]则在一项随机临床试验中观察到，2 型糖尿病患者在诊断时立即开始持续2-3 周的强化胰岛素治疗，可以使β细胞功能得到恢复，在停止胰岛素治疗后，患者还可以继续保持数月至两年的血糖正常的状态。使用短期强化胰岛素治疗的多个研究表明，大概40%的患者在强化胰岛素治疗后24个月仍然可以保持正常的血糖水平[37]。

除胰岛素外，在GLP-1 受体激动剂的细胞研究中发现，GLP-1 受体激动剂可以通过上调转录因子7 类似物2（Transcription factor 7 like 2，Tcf7l2）基因来抑制高糖导致的胰岛β细胞的去分化，表现为相较于对照组，祖细胞标志物的表达减少（P＜0.05）[38]。Hou 等[39]将重组蛋白E2HSA 处理组（exendin-4 与人血清白蛋白融合产生的一种新型长效GLP-1 受体激动剂）分别给予1 mg·kg-1、3 mg·kg-1、9 mg·kg-1不同剂量，发现在43 天的治疗期间，1 mg·kg-1、3 mg·kg-1和9 mg·kg-1剂量组的E2HSA 均以剂量依赖的方式显著降低了db/db小鼠空腹血糖水平，并恢复了β细胞形态，增加β细胞面积，抑制β细胞凋亡。E2HSA（9 mg·kg-1）使得IRS2、NKX6.1 和MafA 的表达增加了1.8 倍、上调了PDX1 的表达，增加FOXO1 磷酸化的水平，并且降低了促凋亡Bcl-2 蛋白的表达，这些结果表明E2HSA 促进了β细胞功能的恢复。

其他降糖药物的研究，目前主要集中在促进β细胞的增殖和保护β细胞功能方面，虽然没有得出关于β细胞去分化方面的结论，但是很多实验过程中发现了去分化标志物的变化。例如，在SGLT-2 抑制剂的研究中，Okauchi 等[40]分别给予10 周大的雄性糖尿病db/db 小鼠0.0025%或0.01%的鲁格列净（Luseogliflozin）治疗，发现在干预3 天后，与对照组相比，鲁格列净治疗组显著提高了胰岛素1、胰岛素2、MafA、PDX1 和GLUT2 基因的表达水平，降低了转化生长因子β信号通路（Transforming growth factor-β，TGFβ）、纤维连接蛋白、I 型胶原和III 型胶原等纤维化相关基因的表达水平；在噻唑烷二酮（Thiazolidinediones，TZDs）类药物的研究中，Ishida[35]等总结发现，罗格列酮可以恢复FOXO1 在β细胞中的表达。其他降糖药物如DPP-4抑制剂西格列汀[41]、二甲双胍[42]均被证实可以改善β细胞的功能，但并没有抑制和逆转β细胞去分化方面的报道。

除此之外，也有研究者通过细胞实验和动物实验证实肾素- 血管紧张素- 醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system,RAAS）可能通过作用于血管紧张素受体1（Angiotensin Ⅱreceptor type 1，AT1R），诱导NF-Kb 信号通路的激活从而诱导β细胞去分化。因此，阻断RAS或NF-Kb信号也可以逆转血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）诱导的β细胞的去分化状态[43]。

中药单体的研究过去主要集中在促进胰岛β细胞的增殖方面，现在抑制和逆转β细胞去分化方面的潜力也开始引起学者的关注[44]。例如，红景天可促进胰岛素、PDX1 等基因的mRNA 表达，降低白细胞介素1β（Interleukin 1 beta，IL-1β）水平，使得β细胞数目增多[45]]。白藜芦醇能促进β细胞分化和成熟，以及促进干细胞系产生PDX1[46]。儿茶素没食子酸酯（绿茶提取物）也被证实至少部分可以通过增加IRS2、AKT、FOXO1 和PDX1 的表达来改善β细胞在糖毒性条件下的胰岛素分泌功能和生存能力，并且还可保护β细胞免受促炎细胞因子诱导的细胞毒性的伤害[47]。富含花青素-3-葡萄糖苷的杨梅果实提取物（Bayberry fruit extracts，BFE）也被证明可防止氧化应激诱导的β细胞损伤，BFE（含0.5μM 氰化-3-葡萄糖苷）可抑制β细胞内线粒体反应性氧化物生成，以及上调PDX1 与胰岛素样生长因子Ⅱ基因（Insulin-like growth factor 2，IGF-Ⅱ）的表达等[48]。

4 结语

综上所述，β细胞去分化是导致β细胞功能缺陷的重要机制，且这一过程可以被抑制和逆转。FOXO1作为可以影响β细胞去分化的重要核转录因子，为β细胞功能研究提供了一种新的思路和方向。现有证据表明，饮食和体重的控制，以及使用胰岛素对于抑制和逆转短病程的T2DM 患者的β细胞的去分化确有疗效。这个结果也与饮食和运动疗法应该保留在整个糖尿病治疗过程中的治疗理念一致。但对长病程DM患者而言，上述措施对调节β细胞去分化的作用并不明显。除饮食运动以及胰岛素外，其他降糖药物以及一些中药提取物在抑制和逆转β细胞去分化方面也显示出一定的作用，关于药物作用于β细胞去分化的潜在机制，需要我们进一步的研究以明确。