Graves病动物模型构建的研究进展

冒婧敬, 相萍萍, 2, 刘 超, 2

(1. 南京中医药大学附属中西医结合医院 内分泌代谢病中心, 江苏 南京, 210028;2. 江苏省中西医结合医院 内分泌科, 江苏 南京, 210028)

Graves病(GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，典型临床表现为高代谢症候群，甲状腺弥漫性肿大，部分患者可伴有Graves眼病或局限性胫前黏液性水肿[1]。GD的发病机制主要是促甲状腺激素受体(TSHR)与促甲状腺激素受体抗体(TRAb)结合，刺激甲状腺激素大量释放，甲状腺滤泡增生，从而导致甲状腺功能亢进[2]。其中TRAb是一种自身免疫性抗体，分为刺激性抗体(TSAb)以及阻断性抗体(TBAb)。在GD患者中，以刺激性抗体TSAb表达为主[3]。鉴于TSHR与GD发病相关，目前GD造模多以此为切入点。本文就GD模型构建造模材料、造模方法、造模成功指标等方面的研究进展进行综述。

1 改进造模材料构建GD模型

TSHR可在体内产生抗原性抗体与抗原表位相结合，导致GD发生，故GD模型的构建多基于表达TSHR的基础。现有的造模方法主要包括采用表达TSHR的细胞、表达TSHR的质粒DNA以及表达TSHR的重组腺病毒。

1.1 表达TSHR的细胞免疫

1996年SHIMOJO N等[4]首次成功建立GD模型，研究者以携带人TSHR基因的真核表达载体转染RT4.15HP后的细胞为载体，免疫AKR/N(H-2K)小鼠，每2周免疫1次，共计6次，最终约25%的模型小鼠出现总甲状腺素(T4)水平增高、TSAb阳性及甲状腺弥漫性肿大，提示造模成功。此后，有学者[5]采用表达人TSHR和小鼠TSHR的M12(hM12、mM12)细胞免疫BALB/c小鼠，最终成功诱导TSAb、T4水平升高并出现典型甲亢症状; 而后应用表达TSHR的重组腺病毒转染树突状细胞并注射免疫BALB/c小鼠，亦成功诱导约25%的小鼠出现甲亢[1]。但以上造模方式繁琐，均需使用其他载体转染细胞后再免疫小鼠，且成模率较低、稳定性差等，逐渐淡出研究者视线。

1.2 表达TSHR的质粒DNA

表达TSHR的质粒DNA也可有效诱导GD发生。既往研究[3]发现，将表达TSHR的质粒DNA(pc DNA 3.1-TSHR)在小鼠双侧股四头肌注射，结果小鼠体内血清TRAb浓度增高, T4、TSAb水平均增高，而TBAb水平差异无统计学意义; 甲状腺组织呈现甲状腺滤泡增生、胶质浓缩等GD的病理表现，提示该质粒可有效建立GD小鼠模型。同样, XIA N等[6]采用pcDNA3.1质粒载体构建pcDNA3.1-T289重组质粒DNA, 使90%小鼠出现明显的甲状腺肿大和甲亢表现, 80%实验小鼠血清T4、TRAb水平显著升高合并甲状腺滤泡肥大和增生，同时MRI显像能明显观察到小鼠眼眶肌肉成纤维细胞增大，提示应用质粒DNA可成功构建GD小鼠模型。此外, pcDNA3.1-TSHR268 重组质粒也可显著提高小鼠模型的TSHR水平[7], 但重组质粒免疫的小鼠常会出现甲减而非甲亢[8]。质粒DNA重组方式多样，一部分如pBacMam-2或pTriEx-1.1构建的质粒DNA, 具有更高的稳定性，但代价较高[9]。部分质粒DNA在短期实验中无法有效诱导小鼠发生GD[6]。上述不足限制了质粒DNA的应用，仍有待进一步完善。

1.3 表达TSHR的重组腺病毒

相对于质粒DNA载体，采用表达TSHR全长或TSHR A亚单位的重组腺病毒造模重复性更好，成模率更高。GD 的发病是由于TSHR结构发生异常改变，在二硫键异构酶以及蛋白酶酶解作用下，连接A、B 2个亚单位的二硫键发生溶解断裂, TSHR-A亚单位脱落表达于细胞表面，诱发并增强自身免疫反应[10]。脱落出来的A亚单位三聚体结构与致病性TSAb的抗体具有更高的亲和力[11]。

CHEN C R等[12]在2003年构建重组腺病毒Ad-TSHR289, 造模成功率高达86%, 并具有高度可重复性，同时还发现应用表达TSHR-A亚单位的腺病毒比表达TSHR全长者具有更高的造模成功率, TSAb活性也更高。此后，研究者多采用表达TSHR-A亚单位的重组腺病毒进行造模。伍丽萍等[13]为比较表达TSHR的质粒DNA和腺病毒的造模效果，分别建立质粒组和病毒组小鼠模型，质粒造模组予pcDNA3.1-TSHR 50μg皮内注射，造模组予肌肉注射Ad-TSHR289, 重组腺病毒造模组中所有小鼠的TRAb和T4水平均升高, 8只小鼠中6只出现甲状腺增大、甲状腺滤泡组织增生等甲亢症状，而质粒造模组仅2只小鼠出现较弱TSHR抗体反应且总T4水平没有升高，甲状腺组织未发生增生性改变。另一研究[14]发现，应用TSHR重组腺病毒A亚单位长时间(3～4周)免疫BALB/c小鼠可以显著增加小鼠抗TSHR抗体滴度，促进TSHR依赖性cAMP水平提高; 同时能够促使小鼠出现典型甲状腺肿、甲状腺滤泡组织明显增大，且上述作用可维持长达9个月，此外，模型小鼠还出现了心脏肥大、心脏重量增加以及心动过速现象。以上研究表明重组腺病毒建立GD模型更稳定、成功率更高。尽管该法还需进一步改进，但仍是目前GD造模材料的最佳选择[15]。

2 改进造模方法构建GD模型

2.1 改进给药途径

目前GD模型的制备可采用多种给药途径，主要包括腹腔注射、股四头肌肌肉注射、尾静脉注射以及电穿孔注射等方法。

早期采用表达TSHR的细胞免疫小鼠时，多采取腹腔注射细胞，但该法成模率低，逐渐被淘汰。肌肉注射是目前应用最广泛的给药方式，无论是采用表达TSHR A亚单位的腺病毒还是质粒DNA都可采用肌肉注射且效果较好。赵紫琴等[3]对BALB/c小鼠双侧股四头肌注射pcDNA3.1/hTSHR(188～403 bp)质粒DNA, 每3周1次，共免疫5次，在第2次免疫后发现小鼠T4、TRAb以及TSAb水平显著升高，病理显示甲状腺滤泡增生，提示成功建立了GD模型。

电穿孔(EP)载药也是造模的有效方法之一。电穿孔介导pC1-hTSHR289His-IRES-CD4 载体免疫小鼠，可使其发生甲亢并可检测出高滴度TSAb抗体，且该抗体活性明显高于多数模型[16-17]。与构建病毒载体相比，电穿孔表达载体快捷、方便，无需建立表达或突变体的细胞系。重组质粒pcDNA3.1/TSHR268加电穿孔方法也可成功构建GD动物模型[18], 在造模第4周时，小鼠血清中T4、TRAb羧基端抗体和氨基端抗体水平均达到最高值，停止免疫后18周仍明显高于免疫前水平，提示电穿孔法或可延长GD的成模时间。不仅如此，电穿孔法还有助于诱发甲亢突眼，产生显著的眼眶肿大、肉眼可见的眼结膜水肿、眼眶血管扩张和堵塞[19]。故利用肌肉注射与电穿孔技术，通过表达载体重复免疫后，均可成功造模GD小鼠模型，成功率较高。目前，比较肌肉注射与电穿孔免疫的造模效果的研究较少，但有研究发现，通过电穿孔方法传导腺病毒会导致小鼠在最后1次免疫的4月后死亡[20], 故仍需更多研究证明两者的优劣性。

2.2 改变给药时间及免疫次数

GD小鼠免疫周期不完全一致，从2次免疫后2周到3次免疫后8周不等，但多集中在2次免疫后2周及3次免疫后4周。

研究[21]发现，每3周1次，共3次，末次免疫后4周造模为GD小鼠模型的最佳免疫周期，该免疫周期下，实验小鼠血清TRAb水平能达到最高水平, T4水平升高，并能持续8周。叶枫等[22]比较第2次免疫后2周与第3次免疫后4周的造模效果, 2组小鼠TRAb水平均明显升高，而其中3次免疫4周造模组的成模率(75%)最高，且其甲状腺组织改变与 T4 水平变化吻合度为100%。同样, CHEN C R等[11]选用重组腺病毒A亚单位免疫BABL/c小鼠，分别比较2次免疫后1周(5周造模)，末次免疫后4 周(10周造模)及8周(14周造模)小鼠的TRAb及T4水平，结果发现5周造模组TRAb滴度及甲亢发生率与10周造模相似，而14周造模组的抗体水平及T4升高的阳性率略低于10周造模组，表明造模时间并非越长越好。HOLTHOFF H P等[14]发现利用重组腺病毒每3～4周进行一次免疫，连续免疫9次，可使模型维持时间延长至9个月，是迄今为止最长维持时间，提示造模时间及免疫次数对GD模型有重要影响。

2.3 调整动物品系

不同小鼠品系对相同抗体会产生不同反应, SAITOH O等[23]发现，使用AdTSHR289抗体免疫C57BL6以及BALB/c雌性小鼠时，小鼠体内均可产生TSAb抗体，但只有BALB/c小鼠会出现甲亢病征。与C57BL6小鼠相比, BALB/c小鼠能够产生更多的TSAb, 且能产生甲状腺组织的生理变化和眼眶组织的改变[24], 故BALB/c小鼠是目前研究GD造模的主要小鼠品系。此外，一种NOD. H2h4小鼠可自发产生免疫性甲状腺炎，甲状腺球蛋白抗体、以及甲状腺过氧化物酶抗体，但不能产生TSHR抗体，通过将人TSHR A 亚单位转移至NOD. H2h4小鼠后，该转基因小鼠可自发产生TSAb[25-26], 为GD提供了新模型，但该小鼠模型研究较少，无法保证其可重复。通常情况下，雌性小鼠本身更容易出现自身免疫性疾病，但有研究[27]发现在相同的GD模型实验条件下，雄性小鼠TSH、FT4的表达水平会比雌性小鼠更高，但性别对于小鼠GD造模的具体影响尚不明确。此外，王悦等[28]通过肌肉注射重组腺病毒，将猕猴与小鼠进行GD造模对比，发现与猕猴相比，小鼠模型GD甲亢的诱导时间更短，发生率更高，同时GD猕猴基础生理生化指标和免疫相关指标中显示出更多与人类GD患者类似的表现及机制。该实验可为日后探索GD发病机制及评估新治疗方案研究提供新的造模动物类型，可以根据2种动物GD模型的不同特点选择更合适的研究工具。

3 鉴定造模成功的指标

检测GD造模成功的指标有很多种，临床上GD主要以甲状腺毒症所致高代谢症状和体征、甲状腺弥漫性肿大、TRAb阳性，以及T3、T4水平增高和TSH水平降低为主。若症状不明确，可进一步测定放射性碘(RAIU)摄取率(增高)或进行甲状腺B超确诊[2]。

对于GD小鼠造模病理和指标变化可分为以下几个方面。① 临床症状: 出现一系列甲亢临床表现如体质量减轻等; ② 实验室指标: 甲状腺素水平增高或促甲状腺素水平降低; 血清TRAb阳性，尤其是TSAb水平; ③ 形态学变化: 甲状腺增大，甲状腺滤泡上皮细胞增生，滤泡胶质浓缩或乳头状增生等甲亢表现[29-30]。理想的GD小鼠模型需要同时具有生化指标变化和甲状腺病理变化。

4 小 结

GD的造模始终是当前疾病研究中的难点。近年来，经过多方面的探索，目前已能够成功建立一个长期并且稳定的GD小鼠模型。上述研究提示，经3次应用表达促TSHR-A亚单位腺病毒免疫BALB/c小鼠，免疫后4周造模效果最佳, TSHR抗体水平明显增高，血清T4水平升高，甲状腺滤泡上皮细胞增生肥大，滤泡腔中胶质含量减少或缺失等一系GD体征出现，为目前较为理想小鼠GD模型。

然而，不同研究者采取的终点时间并不一致，同类别小鼠以及相同免疫时间中免疫周期亦不相同，从2 次免疫后2周到3次免疫后8周不等，部分实验免疫时间不足导致实验结果不够精准，缺乏可比性，故不同免疫时间及周期对于GD小鼠造模的影响并不全面，需要更多免疫时间和周期不同的GD小鼠造模实验以及同类型条件的对比，以提供更加合理且有效的模型。从给药途径来看，目前电穿孔造模成功率较高，但其操作难度较大且耗费较高，并有小鼠死亡个例，故肌肉注射可能更为经济且常用。此外，更多类别人工合成质粒DNA及重组腺病毒等造模材料有待发掘，为GD小鼠模型的构建提供更加高效、便捷的造模条件。目前对于小鼠品系的研究较少，常用小鼠仍为BALB/c小鼠，对于其他品系如NOD. H2h4等新型鼠种以及猕猴等其他动物种类，需进一步研究其可行性。转基因模型作为自发性的GD模型似乎具有更加广阔的前景，该模型可传代，可供深入研究母体及子代GD的发病机制。

综上所述，目前现有GD模型各有特点，但仍非理想的GD模型，例如伴有Graves眼病的模型仍不稳定，或者无法展现GD的多系统损害等表现。未来仍需更深入的研究以优化GD的造模方式，提高造模效率，为加深GD的病因学及发病机制的认识提供依据。