血浆循环游离DNA 作为肿瘤诊断标志物的研究进展

王玉乐，阳丹才让通信作者)

（青海大学附属医院 肝胆胰外科，青海 西宁 810000）

0 引言

肿瘤是严重危害人类健康和生命的一种疾病[1]，其复发率、病死率较高，目前仍缺乏特效药物治疗，而及时有效的手术治疗与预后密切相关。但因多数肿瘤患者起病隐匿，且缺乏特异性临床症状，早期不易被发现，而错失最佳手术时机。因此寻求高度敏感性和特异性的诊断标志物十分重要。近年来国内外已有较多研究表明，血浆循环游离DNA（cfDNA）作为新兴肿瘤标志物的重要价值及临床应用前景。甚至可视其为补充或替代传统组织活检的新方法，这使cfDNA 分析成为具有吸引力的检测手段。本文现从cfDNA 的来源、释放机制，检测方法等方面来探讨其在肿瘤领域中作为诊断标志物的研究进展。

1 cfDNA 的来源及释放机制

血浆循环游离DNA（cfDNA）不仅存在于血液中，在淋巴、唾液、尿液、粪便、脊髓液和羊水中已检测到它的存在[2]。1948年，Mandel 和Métais[3]首次在健康人和患者的血液中检测到DNA 和RNA。在肿瘤学领域，1977 年，Leon 等[4]报道肿瘤患者体内 cfDNA 浓度高于健康人，这为肿瘤领域的生物医学应用开辟了道路。直到1994 年研究者们从肿瘤患者外周血中检测到了突变的RAS 基因片段[5]，至此，cfDNA 的重要意义才逐渐被重视。随后相关研究证实了肿瘤患者血液中检测出的突变基因片段与肿瘤组织中检测到的结果一致[6-7]。近年来随着研究者对cfDNA 的研究不断深入，随着精准医疗的提出，临床上针对cfDNA 更多是肿瘤学领域的研究。较多研究已表明血浆cfDNA 最终可能成为肿瘤疾病的筛查、无创诊断、预后评估、治疗监测和癌症后续检测的合适靶点[8]。但cfDNA 来源的释放机制尚不清楚。目前认为cfDNA 主要是通过肿瘤细胞发生凋亡、坏死及分泌等方式释放。多以凋亡为主[9]。凋亡细胞的的特征是形成梯状条带。相关研究[10]发现cfDNA 有凋亡特征性条带。因此认为cfDNA 的释放多由肿瘤细胞发生凋亡所致。此外，学者们提出的“细胞坏死假说”，“细胞分泌假说”也解释了cfDNA 的释放机制。肿瘤的发生、发展是极其复杂的过程，不同类型肿瘤存在各自不同特点，因此对于肿瘤患者的cfDNA 来源及释放机制应综合进行分析。

2 cfDNA 的检测方法

随着研究的不断深入，循环肿瘤DNA(ctDNA) 浓度较低使过去的检测手段受限，不能有效的从cfDNA 中区别出ctDNA。近年来随着分子生物学检测技术的发展，越来越多方法用于检测cfDNA，且敏感性及特异性也不断提高。目前针对cfDNA 的检测主要基于PCR 和二代测序（NGS）的方法。两者检测的原理、优缺点、特异度、灵敏度各不相同，需根据研究目的灵活选择，建立统一标准。

2.1 实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法

qPCR 是一种在DNA 扩增反应中，以荧光化学物质实时检测循环聚合酶链式反应后产物总量的方法[11]。具有操作简便快速、灵敏度高、成本低等优点，目前是cfDNA 定量的主流方法。Punnoose 等[12]采用基于TaqMan 技术的qPCR 对25例非小细胞肺癌患者检测，在88%的患者的中可检测出至少一种基因突变。扩增受阻突变系统（ARMS-PCR）技术是通过在特定区域设计引物来检测突变基因[13]。该方法检测灵敏度高，是PCR 检测方法的代表。Duan 等[14]使用ARMS 方法对94 例非小细胞肺癌患者进行EGFR 突变检测，结果显示ctDNA 与组织中检测出的结果具有较高一致性，敏感度和特异度为50%、100%。其他基于qPCR 基础上改良的新方法，如如 COLD-PCR、LNA / DNA-PCR、PNA clamp-PCR 也相继被报道，但其应用的可靠性，仍需大规模的临床验证。

2.2 数字PCR（dPCR）检测方法

dPCR 是核酸分子绝对定量的一种技术，被广泛用于量化cfDNA 水平。与qPCR 相比，两者技术上类似，但对核酸分子定量方式差别较大[13]。dPCR 技术具有更高的准确性、灵敏度及重复性。其中以磁珍乳液扩增发（BEAMing）为代表。BEAMing 技术是数字PCR 结合流式细胞术的检测方法。这种技术主要有小珠、乳浊液、扩增、磁性4 部分组成。Thress等[15]利用BEAMing 技术对72 例EGFR 基因突变阳性的肺癌患者进行检测，其敏感性达82%-87%，特异性达100%。但该检测技术成本高、操作复杂，且会增加实验误差，目前临床应用率低。此外微滴数字PCR（ddPCR）也在肿瘤中得以应用，对cfDNA 的检测有良好效果。

2.3 高通量测序技术（NGS）

NGS 技术又称二代测序技术，它使得在保证敏感性的基础上检测出ctDNA 中肿瘤特异性基因突变成为可能。这种高通量测序具有非常高的敏感性，能精确检测到治疗过程中ctDNA的变化，是目前公认最有效的分析方法[16]。全基因组测序、全外显子测序、标记扩增深度测序（TAM-Sep）、肿瘤个体化深度测序（CAPP-Seq）已用于肿瘤的检测。其中以TAM-Sep 和CAPP-Seq 为代表。TAM-Sep 技术是利用定制化突变位点库作为筛选器，对样本进行靶向捕获后再进行深度测序，灵敏度及特异度更强[17]。据报道[9]此方法检测出突变率达2%，特异性高达97%，还能发现肿瘤中新型未知突变。CAPP-Seq 属于一种捕获测序技术。其基本原理是利用特异性引物进行目标区域扩增，再利用不同特性接头标签二次扩增。通过对样本行双重深度测序，提高特异性及敏感性。该技术对ctDNA 的检测特异度最高，适用于临床应用[13]。然而，NGS 在临床中的应用还存在很多问题，该技术的昂贵和庞大数据的处理，以及高质量的样本的采取仍是目前需要解决的问题。

3 cfDNA 在肿瘤诊断中的进展

目前cfDNA 被认为是肿瘤领域最具发展潜力的分子标志物。很多肿瘤从发病初期到晚期需20-30 年时间，而早期发现肿瘤，尤其在影像学诊断出肿瘤之前发现病变是世界性难题。而对人体血液中cfDNA 的检测，使得在影像学尚未发现病灶时就提示肿瘤存在成为可能。通过对乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌等多种肿瘤的研究，认为cfDNA 是一种潜在的肿瘤早期诊断、预后判断、疗效评估的有利手段。尤其对于肿瘤转移患者，组织活检有禁忌症的患者，cfDNA 的检测替代组织活检将成为可能。

3.1 cfDNA 与乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。多项研究已经表明cfDNA 检测在出现症状前期具有早期发现乳腺癌的潜力[18-19]。Beaver 等[18]使用ddPCR 技术对29 例早期乳腺癌患者手术前后血浆ctDNA 进行了分析，发现有15 例PIK3CA肿瘤基因突变，其中14 例在术前的cfDNA 中检测到。对14例患者中的10 例进行术后检测cfDNA，其中5 例术后仍可检测到PIK3CA 突变。在早期乳腺癌手术前后可使用ddPCR技术检测ctDNA，促进乳腺癌的早期诊断。Olsson 等[20]应用ddPCR 技术连续监测20 例早期乳腺癌患者的ctDNA，发现监测ctDNA 预测肿瘤复发的准确率高达93%，比临床发现复发转移早11 个月。ctDNA 检测能预测复发乳腺癌患者化疗的风险，能为个体化治疗方案的制定提供依据。cfDNA 在乳腺癌的早期筛查、诊断、预后和治疗中具有潜在的应用价值。

3.2 cfDNA 与结直肠癌

结直肠癌是世界第三大最常见的癌症类型，也是癌症死亡的第四大原因[21]。约一半结直肠癌患者诊断时已处于晚期，显著降低了治疗的有效性。已有研究表明ctDNA 可能是结直肠癌可靠预后因素，可作为残留病变的非侵入性标志物。Cassinotti[22]和Frattini 等[23]观察到结直肠癌初次手术切除后cfDNA 浓度明显降低，但复发患者cfDNA 水平显著升高。这表明术后检测cfDNA 可能是早期发现癌症复发的一种很有前途的工具。Diehl 等[24]研究发现术后可检测到ctDNA 的结直肠癌患者一般在1 年内出现复发，认为ctDNA 是肿瘤的特异性生物标志物。cfDNA 的检测在结直肠癌中的应用也具有很好的前景。

3.3 cfDNA 与肺癌

肺癌是世界癌症死亡的主要原因。手术是早期肺癌患者首选的治疗方法，其次是辅助治疗。然而，复发是常见的，临床上迫切需要能够预测癌症复发风险的生物标记物，以优化治疗策略。Wenwei 等[25]在一项前瞻性研究中表明肺癌的大多数EGFR 基因突变可以在患者血浆中检测到，EFGR 基因突变水平可能是判断手术治疗预后的生物标志。早期肺癌患者血浆中EGFR 基因突变具有独立的诊断价值和预后价值。迄今为止，已有多项研究表明cfDNA 中检测到的EGFR 基因突变与非小细胞肺癌患者肿瘤组织中检测到的基因突变高度一致。2016 年，ctDNA 已被美国FDA 批准作为首次液体活检（cfDNA 检测）试验来鉴定具有EGFR 基因突变的非小细胞肺癌患者[26]。这表明cfDNA 在肺癌诊断、预后及指导个体化治疗方面具有重要的意义。

4 小结与展望

近年来，随着分子生物技术的不断发展，cfDNA 作为肿瘤的一类重要分子标志物正在从研究领域向临床应用转化。cfDNA 在肿瘤中的诊断、疗效评估、复发预测及治疗方案选择等方面具有重要价值。然而，目前仍有较多问题需进一步探索及研究，如cfDNA 的分析缺乏统一标准，且cfDNA 浓度低，检测时可受到其他非肿瘤疾病的影响而产生假阳性等。尽管二代测序是目前检测cfDNA 最有效的方法，但昂贵的费用及庞大的数据处理，使其临床应用一定程度上受限。相信未来通过更多、更大样本量的研究及检测技术的不断进步，这些问题将逐步得到解决。