基于响应面分析法优化蚕蛹总黄酮的提取工艺研究

刘开莉 梁贵秋 许忠裕 周晓玲 肖 潇 陆春霞*

(1.广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007；2.广西壮族自治区农业科学院，南宁市 530007)

随着蚕桑业的发展，蚕蛹也不断被人研究，其食用价值、医药价值以及其他领域的利用率相当高[1]。两广二号是广西当前主要的家蚕品种，是由广东省农科院蚕业所与广西壮族自治区蚕业技术推广总站(原广西蚕业指导所)合作共同选育的品种，1996年通过全国农作物品种审定委员会审定[2]。两广二号家蚕品种适合多个地区推广饲养，具有体质强健、抗病性强、好饲养等优点[3]。其蚕蛹更是具有很高的经济价值，含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、黄酮类化合物、多酚等营养和活性成分[4]。生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一类天然的产物，在植物界广泛存在，是一类极具开发价值的化合物[5]。方洪帅等[6]通过提取葛根总黄酮对患有糖尿病的小鼠进行灌胃测定空腹血糖含量，表明总黄酮具有降血糖作用。黄酮类化合物还具有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化以及保护心血管和肝脏等生理作用[7]。

总黄酮的提取方法有溶剂提取法[8]、超声提取法[9]、酶制取法[10]等，本研究以两广二号品种家蚕为研究对象，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法[11]优化蚕蛹总黄酮提取工艺，并选出最佳工艺测定蚕蛹总黄酮含量。通过研究，为蚕蛹的食药功能和工艺研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕蛹：广西市售两广二号鲜蛹；芦丁标准品、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：国产分析纯；实验用水纯水，实验室自制。

1.2 仪器与设备

分析天平(JA3003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，数控超声波清洗器(JK-450DB，合肥金尼克机械制造有限公司)，紫外-可见分光光度计(TU-1810PC,上海光谱仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(HH-S2，金坛市易晨仪器制造有限公司)

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

鲜蛹经过60 ℃恒温干燥至恒重后，粉碎成粉，用索氏抽提法进行脱脂，直至磨砂玻璃棒上无油斑表明抽提完毕[12]。准确称取0.1 g(精确到0.001 g)脱脂蚕蛹粉，加入一定体积的乙醇溶液，在100 w功率下超声波处理一定的时间后，放于恒温水浴锅中抽提3 h，放置冷却过滤得到的澄清液即为试样液。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

取20 mg芦丁标准品于50 mL的75%乙醇溶液中溶解，定容至100 mL，即芦丁浓度为0.2 mg/mL。准确吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL标准溶液，用75%乙醇溶液定容至5 mL，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，加入4 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀充分反应15 min。芦丁质量分别为：0 mg、0.1 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.4 mg、0.5 mg。以质量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线(见图1)，计算得回归方程：A=0.5389x+0.0423，R2=0.9979。

1.3.3 蚕蛹总黄酮含量的测定

准确移取1 mL待测样品液，按照标准曲线法测定待测液的吸光度值，由回归方程计算出蚕蛹总黄酮的含量。

1.4 单因素试验与响应面试验设计

1.4.1 单因素试验设计

采用单因素试验，分别考察料液比(1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，g/mL)、水浴提取温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超声提取时间(20 min、30 min、45 min、60 min、75 min)、乙醇浓度(30%、45%、55%、65%、75%)等因素对蚕蛹总黄酮含量的影响，每个单因素试验做3次重复。

1.4.2 响应面试验设计

参考单因素试验的结果分析，选取料液比A(1∶60、1∶70、1∶80，g/mL)、水浴提取温度B(60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超声提取时间C(20 min、30 min、45 min)、乙醇浓度D(30%、45%、55%)等(如表1)，运用Design-Expert8.06软件设计进行响应面试验并分析，确定蚕蛹总黄酮提取的最佳工艺。

表1 响应面试验因素与水平

1.5 响应面试验验证

重复3次试验验证正交试验得到的最佳工艺，分析计算蚕蛹总黄酮的提取含量，并求出相对标准偏差，以确保最佳条件的科学性和稳定性。

1.6 数据分析

单因素试验数据采取直观分析法分析，确定各因素对蚕蛹总黄酮含量影响的参数区间。在单因素的基础上，采用Design-Expert8.06软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 料液比对蚕蛹总黄酮含量的影响

按照试验设计，在料液比分别为1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)时，考察料液比对蚕蛹总黄酮含量的影响，结果见图2。由图2可知：当溶剂从1∶40(g/mL)增加到1∶80(g/mL)时，总黄酮含量逐渐增加，在1∶70(g/mL)时，蚕蛹总黄酮含量达到最大5.28 mg/g，溶剂增大至料液比1∶80(g/mL)以后，蚕蛹总黄酮的含量趋于下降趋势且不再上升。一般来说，溶剂增加有利于蚕蛹总黄酮的提取，含量也增加，到达一定的量时，总黄酮已充分提取，过多溶剂只会造成溶剂和能源的浪费。故选择料液比为1∶70(g/mL)。

2.1.2 水浴提取温度对蚕蛹总黄酮含量的影响

按照试验设计，分别在提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃时，考察水浴提取温度对蚕蛹总黄酮含量的影响，结果见图3。由图3可知：随温度的升高，总黄酮含量先增加再下降，在温度为70 ℃时，总黄酮含量达到最大8.27 mg/g。其原因可能是温度过高，使总黄酮成分发生变化，导致含量降低。故选择提取温度为70 ℃。

2.1.3 超声提取时间对蚕蛹总黄酮含量的影响

按照试验设计，在提取时间分别为20 min、30 min、45 min、60 min、75 min时，考察超声提取时间对蚕蛹总黄酮含量的影响，结果见图4。由图4可知：随提取时间的增加，总黄酮含量呈现先增加后下降的趋势，在提取30 min时达到最大值9.14 mg/g。提取时间增加，总黄酮含量趋于平缓且有下降趋势，其原因可能是时间过长，使总黄酮成分发生变化而导致含量降低。综合考虑，选择提取时间为30 min。

2.1.4 乙醇浓度对蚕蛹总黄酮含量的影响

按照试验设计，在乙醇浓度分别为30%、45%、55%、65%、75%时，考察乙醇浓度对两广二号家蚕蚕蛹总黄酮含量的影响，结果见图5。由图5可知，随着乙醇浓度的升高，总黄酮含量呈先上升后平稳下滑的趋势，在45%时达到最大5.73 mg/g。乙醇浓度继续升高，总黄酮含量下降，其原因可能是乙醇含量的增加使总黄酮提取率下降。故选择乙醇浓度为45%。

2.2 响应面试验结果与分析

响应面试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。响应面试验共有27个试验点，其中22个析因点，5个中心点。应用响应面分析试验结果，得到以蚕蛹总黄酮含量为响应面的回归方程为：

总黄酮含量=4.43-0.81A+0.51B+0.25C+1.55D-0.87AB-0.24AC-2.27AD+0.052BC-0.57BD-0.65CD+0.81A2-0.240B2+0.078C2+0.91D2

表2 响应面试验设计与结果

表3 蚕蛹总黄酮回归模型的方差分析结果

由表3方差分析结果可知，模型P<0.0001，说明回归模型极显著；失拟项(P=0.2125>0.01)不显著，说明模型拟合效果好，可信度高；模型相关系数=0.9854与调整确定系数=0.9708相差较近，说明该模型拟合程度好，可以用于指导蚕蛹总黄酮提取试验设计。各因素对总黄酮含量的影响由大到小顺序依次为乙醇浓度、料液比、水浴提取温度、超声提取时间。4个因素对蚕蛹总黄酮含量的影响均达极显著。通过图6各因素交互作用对蚕蛹总黄酮含量影响的响应面等高线图和三维图，可直观地反应各因素对响应值总黄酮含量的影响，并可以分析出各因素之间相互作用。

由图6各因素交互作用对蚕蛹总黄酮含量影响的等高线图和三维响应面图可知，料液比与水浴提取温度的交互作用、料液比与乙醇浓度的交互作用、水浴提取温度与乙醇浓度的交互作用、超声提取时间与乙醇浓度的交互作用对蚕蛹总黄酮含量有显著影响；料液比与超声提取时间的交互作用、水浴提取温度与超声提取时间的交互作用对总黄酮的含量影响不显著。

经过Design-Expert8.06软件分析，可以得出蚕蛹总黄酮提取的最佳条件为：料液比1∶60，水浴提取温度79 ℃，超声提取时间20 min，乙醇浓度55%,预测蚕蛹中总黄酮含量为10.54 mg/g。

2.3 优化检测条件验证试验

为了验证优化检测条件的稳定性和可靠性，按上述最佳检测条件进行了3次重复性试验，得到蚕蛹中总黄酮含量分为10.54 mg/g、10.50 mg/g、10.58 mg/g，平均值为10.54 mg/g，与预测值10.54 mg/g相比，相对标准偏差为0.30%。结果表明此工艺可靠、稳定。

3 结 论

本研究采取单因素结合响应面试验的方法，在考察料液比、水浴提取温度、超声提取时间、乙醇浓度分别对蚕蛹总黄酮含量影响的基础上，采用Design-Expert8.06软件的中心组合设计方法设计响应面试验，得到各因素对蚕蛹总黄酮含量影响的大小顺序依次为乙醇浓度、料液比、水浴提取温度、超声提取时间。优化蚕蛹总黄酮检测的最佳条件为料液比1∶60、提取温度79 ℃、提取时间20 min、乙醇浓度55%。在该检测条件下，蚕蛹中总黄酮含量为10.54 mg/g。本研究为两广二号蚕蛹总黄酮的检测以及开发利用提供了有利依据。