不同柞蚕品种热激处理后F1代幼虫的ApNPV抗性研究

张 博 谌苗苗 冀万杰 赵春山 李喜升 王凤成

(辽宁省蚕业科学研究所，国家蚕桑改良中心辽宁柞蚕分中心，辽宁省野蚕研究重点实验室，辽宁凤城 118100)

柞蚕核型多角体病毒是危害柞蚕的主要病原，在我国的辽宁、吉林、山东、黑龙江、内蒙古、河南等省每年均有不同程度的发生，在辽宁省严重时发病率可达50%以上，有的年份个别地区发病率竟高达80%以上。给广大养蚕农户造成很大的经济损失。尤其最近几年，该病的发生呈加重趋势[1-2]。因此，柞蚕品种对于ApNPV的抗性是评价品种生产性状的一项重要指标。

热激蛋白是在热激条件下产生的一种特殊蛋白，此外其他外界刺激，如缺氧[3]、中毒[4]、缺乏能量[5]、病毒侵染[6]等，也能够刺激机体产生热激蛋白。它在进化上高度保守，且在生物体内具有重要的生理意义，参与热耐受[7]、免疫调控、细胞凋亡、病毒感染等生理过程[8]。

有研究显示，柞蚕21.4 KDa小热激蛋白(Ap-sHSP21.4)在大肠杆菌、白僵菌和ApNPV感染时在柞蚕中肠和脂肪体中高量上调表达。干扰Ap-sHSP21.4基因的合成可导致防御素、多巴脱羧酸酶、溶酶菌等参与免疫调控基因的下调[9]。对5龄家蚕进行42 ℃、15 min短时热激处理可提高家蚕对核型多角体病毒的抗性[10]。

本文将重点介绍高温胁迫后柞蚕F1代稚蚕对ApNPV的抗性对比试验，讨论柞蚕品种热激蛋白表达量差异与ApNPV抗性差异的关联性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的4个柞蚕品种为方山黄、抗大、F、5204，是在2016年耐热性特征研究中筛选出来的4个耐热性比较强的品种，由辽宁省蚕业科学研究所提供。2017年7月，将制备好的上述4个品种的种卵自然温度催青，待孵化出蚕进行试验。

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)由辽宁省蚕业科学研究所柞蚕保护研究室采集留存和提纯。

1.2 柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)原液的制备及各浓度梯度的配制

将提纯的柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)原液以无菌水稀释、匀浆后，血球计数板计算浓度为1.3×109p/mL的溶液作为病毒原液，保存备用。以1.3×109p/mL的溶液作为病毒原液为起始浓度，用灭菌水按10倍稀释法依次逐级稀释，即吸取1 mL 1.3×109p/mL的核型多角体病毒原液和9 mL灭菌水均匀混合得到1.3×108p/mL的病毒溶液，再吸取1 mL 1.3×108p/mL的核型多角体病毒原液和9 mL灭菌水均匀混合得到1.3×107p/mL的病毒溶液，以此类推，依次得到1.3×106p/mL、1.3×105p/mL、1.3×104p/mL、1.3×103p/mL共6个浓度的病毒溶液，本次采用1.3×103～1.3×107p/mL共5个浓度进行试验。

1.3 试验蚕的准备

将供试的4个柞蚕品种按每个品种取10个蛾的卵，搅拌均匀，然后每个品种各取6 g卵平均分成6份置于产卵袋中。用事先准备好的0.5%的氢氧化钠溶液去掉卵表面的粘液，再放入甲醛-盐酸混合溶液中进行卵面消毒，晾干后挂在消毒过的养蚕室内，待孵化前一天采用室内卵面添毒方法，把蚕卵用纱布包好浸泡在5个浓度梯度的病毒液中，对照组浸泡无菌水中，浸泡时间为2 min，晾干装入养蚕袋(已消毒)中待第2天孵化。

1.4 调查方法

蚕卵孵化时，蚁蚕因咬食卵壳而感染核型多角体病毒。将养蚕袋内的蚕(健康且大小均匀)分装在贴有品种名和病毒溶液浓度标签的罐头瓶(已消毒)中，每个品种5个浓度，每个浓度5次重复，每个品种每个浓度各设置一个对照组，每个瓶中饲养10头蚁蚕。温度25～26 ℃，相对湿度80%～85%，每日取新鲜辽东栎叶喂食1次，并且除蚕沙。逐日记录蚕的发育情况，发现病蚕死蚕及时记录并剔除，以免造成交叉感染，对于疑似病蚕，必须经过显微镜检查确认，避免数据误差过大，调查至二眠起结束[11]。

1.5 试验数据处理

利用DPS数据处理系统对4个柞蚕品种(方山黄、抗大、F、5204)抗病性的原始数据进行分析。

1)毒力回归方程方差分析F值及其显著水平。数量型数据毒力回归方程诊断采用方差分析方法进行，这是数量型资料和计数资料在生物测定分析进行模型诊断方面的差异。

2)对四个品种进行几率值分析。DPS系统采用致死剂量比率测定方法来检验各个品种在致死剂量方面的差异：当致死剂量比率的95%置信区间包含1，则各品种的某致死剂量之间的差异不显著。

2 结果与分析

2.1 供试柞蚕品种的ApNPV抗性分析

用1.3×103～1.3×107p/mL共5个浓度梯度的ApNPV溶液分别处理4个品种即将孵化的蚕卵后，调查孵化后各品种的发病率，结果见表1。从中可以看出，处理的病毒溶液浓度越高，参试品种蚕的发病率越高，各品种平均发病率为26.9 %，对ApNPV的感染抵抗性品种存在一定的差异，参试的4个品种中，方山黄的抵抗能力最强，其次是5204、抗大，F的抵抗能力最差。

表1 柞蚕对ApNPV感染抵抗能力调查

采用DPS分析软件对结果进行相应的模型分析，结果见表2。4个柞蚕品种的死亡率和几率值都是随着剂量的增加而逐渐增大，符合ApNPV浓度增大死亡率增大的现象。分析结果显示5204和方山黄稚蚕的抗ApNPV能力较强。但F与方山黄在1.3×103p/mL、1.3×104p/mL、1.3×105p/mL上出现了低浓度死亡率大的结果，需要后期再确定结果的合理性。

表2 不同剂量下4个柞蚕品种的死亡率和几率值

4个柞蚕品种LD50与剂量对毒力的回归方程分析结果见表3，方山黄的LD50值为10.4874，明显好于其他品种，5204的结果较方山黄的结果稍低，也好于其他两个品种，该结果与死亡率和几率值的结果相同。说明方山黄和5204对ApNPV的抗性较强。通过对不同剂量下的4个品种进行毒力结果显著性分析发现，品种F在5个剂量间的毒力结果表现出极显著性差异P<0.01。

表3 四个柞蚕品种的剂量对毒力回归曲线和毒液半数致死剂量

通过毒力回归曲线图1显示：4个柞蚕品种中，方山黄的斜率较低，随着剂量逐渐的增大并没有表现出趋势大幅度变化的现象，说明该品种对ApNPV有相对稳定的抵抗性，且相对抵抗性强于其他品种。虽然F的结果在低剂量上出现死亡个数较多的情况，方山黄存在较高剂量间死亡个数少的现象，但是总体结果能够看出相应的趋势，品种间存在显著性差异结果。

3 讨 论

昆虫在面临温度骤升和微生物胁迫时，会采取提高抗菌肽及热激蛋白基因表达量的策略来应对这些胁迫[9]。本研究的4个柞蚕品种热激处理后F1代的ApNPV抗性比较结果与前期热激处理后各柞蚕品种2种热激蛋白的表达量结果[12]趋势基本一致，均为方山黄>5204>抗大>F。可推测部分热激蛋白家族成员参与柞蚕的ApNPV侵染后相应的免疫调控。即使昆虫没有免疫系统，但也可通过相应的一些胁迫过程达到对机体自身保护作用。后期需要进一步试验划分柞蚕热激蛋白家族在ApNPV侵染后的免疫调控中所起作用的贡献率。

在4个柞蚕品种中，方山黄和5204不仅在遭受高温胁迫时表现出2种主要热激蛋白基因的高量表达，而且在对热激处理后F1代稚蚕添食ApNPV时表现出高抗性，因此推测这2个品种的耐高温与抗ApNPV能力较好。柞蚕品种方山黄已审定并在山东省推广应用多年，可将该品种作为柞蚕耐高温品种选育试验的对照品种。柞蚕品系5204在幼虫具有典型标记表型形状，若对该品种进行继代热激锻炼，将更有可能培育出抗逆型柞蚕新品种。

此外，试验选择的柞蚕卵为热激后的柞蚕F1代，取得的ApNPV抗性比较结果与热激处理后热激蛋白的表达量高低有一定相似性，需要进一步试验确定热激处理后各个柞蚕品种抗逆性是否进行了一定继代效果，从而得到了两个试验结果的一致性。如果确定有抗逆性的继代现象，可以通过逆境处理进行抗逆品种的选育与材料发掘的准备工作。