P-PRP凝胶制备方案研究进展

刘 悦 张雪松

(佳木斯大学 整形外科，黑龙江 佳木斯 154000)

P-PRP由抗凝全血通过离心或过滤获得，含低浓度白细胞和高浓度血小板，P-PRP凝胶是加入激活剂形成的胶冻状物，激活后，血小板通过脱颗粒作用释放多种生长因子，如血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子β1和β2等[1]。本文就P-PRP的制备方案研究进展做一综述。

1 P-PRP的制备过程考查因素

1.1 制备人员的选择

2019年Naoya Kikuchi等学者将2名具有制备经验的骨科医生作为E组，将只看了3次由BTI生物科技研究所制作的具有教育意义DVD的人设为NE组，比较两组制备的PRP有无质的差别，结果表明制备PRP的经验对PRP的质量没有影响，但作者认为还是应尽量选择有经验的人制备[2]。

1.2 抗凝剂的选择

枸橼酸盐抗凝是通过与Ca2+形成难解离的可溶性络合物枸橼酸钙(ACD-A)。ACD-A更接近生理性凝血，有利于保护血小板内信号转导机制，从而提高血小板的整体反应性，所以ACD-A应用更为广泛[3, 4]。抗凝1 mL 血液至少需要6 mg的枸橼酸盐，值得注意的是超过300 mL可能引起低钙血症等中毒反应[5]。

1.3 离心力和离心时间的选择

不同的离心参数对制备出的P-PRP有较为明显的影响[6-9]。P-PRP制备方法包括血液过滤法和密度梯度离心法。Mccarrel TM等学者[10]采用The Purecell Select System for Whole Blood MNC Enrichment,根据制造商说明过滤血液，可得到白细胞减少血，再经Smart Prep 2 system离心，并根据生产商说明重悬，得到白细胞减少PRP。由于其操作复杂，需要特殊设备及耗材，成本较高，所以密度梯度离心法应用更为广泛。密度梯度离心法基于斯托克斯定律。1851年，英国数学家、物理学家斯托克斯发现并提出这一定律，即液体都具有一定程度的粘滞性，体积较小的球形物体在层流速度较小的流体中运动时，粘滞阻力能够运用此定律来描述。该定律提示，血细胞在血浆中的沉降率随离心力的增加而增加[11]，离心力可以加速血小板、白细胞，红细胞在血浆中沉降，并且增加沉降速率的差别，最终在试管内分为血浆层，白细胞层，红细胞层。为最大限度回收血小板，还要选取恰当的离心时间，因其能够确保沉降速率的差别。制备L-PRP与P-PRP的差别在于转移白细胞层，应用移液管转移更为准确有效。密度梯度离心法包括一次和两次离心法，Sanchez M等学者[12]使用抗凝全血以580×g，8 min获得P-PRP,其所含白细胞稀少，血小板浓度是全血的2～3倍，大量实验证明二次离心法提取率、血小板浓度更高，临床应用也更为广泛。第一次选取较小的离心力能降低红细胞间隙中血小板沉积，第二次选取略大的离心力有助于回收血小板且防止其早期被激活[13]。两次离心法有两个影响血小板回收率的主要因素，一是多数血小板保留在血浆层内，没有进入白细胞层被遗弃，且所有白细胞均沉降至白细胞层内，避免为了除去白细胞而损耗血小板；二是确保经第二次离心获取的P-PRP保留血浆层中的大多数血小板，而没有因为在上层血浆中悬浮而随之丢弃[14]。Bausset O等学者使用抗凝全血经Thermo Scientific 以130×g，15 min进行软旋转，随后进行硬旋转，时间为15 min，以不同离心速度进一步浓缩血小板，离心速度分别为130×g、250×g、400×g、1 000×g，结果显示250×g离心时血小板数量大于其他速度，说明高转速可能对血小板功能有害，130×g离心时活化状态的血小板更少，说明较低的离心速度更有利于血小板静息状态的保存，P-PRP中P-selection增加，意味着血小板对激动剂的反应性降低，与400×g相比，血小板浓度较低时，250×g离心速度血小板对激动剂的反应性略有改善，且形态变化较小[15]，因此250×g，15 min或许是富集40 mL抗凝全血中血小板的最佳第二次离心。但Magalon等学者发觉，Bausset法尽管在较多指标方面强于现有的P-PRP制备方案，却不能优化血小板回收率[16]。殷文靖学者认为产生这一结果的原因是Bausset等学者在没有进行试验研究的情况下果断的选择130×g，15 min作为第一次离心方案。前期实验证明，110×g，15 min或许导致部分白细胞遗留血浆层中，180×g，10 min或许导致白细胞层进入多数血小板，另外，180×g，10 min与450×g，15 min之间的第二次离心都能使P-PRP中包含血浆层中的多数血小板。据此殷文靖等通过对照实验选取110×g，15 min至180×g，10 min之间对PCP各细胞含量最有利及180×g，10 min至450×g，15 min之间对血小板功能最有利的两次离心法最佳方案，实验结果表明，各P-PRP样本中白细胞浓度、红细胞浓度、白细胞清除率、红细胞清除率、炎症因子浓度、基础血小板CD62P表达率接近，160×g，10 min能够保证血小板功能并且除去白细胞和红细胞以及尽可能回收血小板[14]，250×g，15 min 相对于较弱方案ADP诱导的CD62P表达率显著升高，意味着可以保证血小板对激动剂的反应性，与更强的离心方案相比血小板回收率和富集度无显著差异，第二次离心是为了尽可能富集血小板并保护血小板功能，综上所述，160×g，10 min续以250×g，15 min或许是使用40 mL抗凝全血制备P-PRP的最佳方案。

1.4 激活剂的选择

将P-PRP运用在临床或科研研究时常应用外源性激活剂将其激活，推动生长因子自血小板α颗粒释放[17]。P-PRP样本加入激活剂得到的凝胶内生长因子浓度可达到全血3～7倍[18]，凝血酶激活剂使血小板10 min内释放70%生长因子，且能使几乎全部生长因子1小时内释放[19]，但常用的凝血酶激活剂通常为牛来源，牛凝血酶在使用中存在不确定性，因为其在使用过程中通常会形成人凝血蛋白抗体[20, 21]，可能引发致命性凝血紊乱，但Mrax认为凝胶中的牛凝血酶剂量少，固化在P-PRP凝胶内，且未进入循环系统，不会导致免疫系统紊乱[22]。冻融循环激活与Cacl2激活的PRP作比较，Cacl2激活可加速凝胶化支架中的纤维蛋白原，得到的P-PRP凝胶中PDGF-BB水平显著升高[2]，而且与牛凝血酶相比其可以避免免疫反应和疾病传播风险[23]，与生理凝血过程更相似，并使生长因子释放更持久[24]，因此Cacl2更适合作为激活剂使用，但其使用小口径针头时注射困难[25]，因此，在临床中需要根据应用部位和治疗目的来选择激活方法。

2 展望

P-PRP凝胶的制备方案随着组织工程技术的进一步发展出现多元化及成熟化的趋势，不同制备方案拥有不同的优点，依据某一项数据独断哪种制备方案最好是错误的，虽然当下P-PRP凝胶在临床应用中的效果存在争论，但无可厚非的是，其在组织修复研究中有广阔的应用前景。