嵌合抗原受体T 细胞疗法在实体瘤应用的新进展

陈思名，白俊

(1.西安医学院，陕西 西安 710021；2.陕西省人民医院肿瘤内科，陕西 西安 710068)

0 引言

CAR-T 细胞免疫治疗是一种利用抗肿瘤免疫力进行癌症治疗的免疫治疗新方法。与传统细胞介导的免疫反应相比，CAR-T 具有改良的肿瘤抗原特异性和单链抗体产生的不依赖主要组织相容性复合分子的细胞毒性[1]。CAR-T 细胞已证实主要在血液系统恶性肿瘤中有效，CD19 导向的CAR-T细胞治疗在晚期化疗耐药的白血病和淋巴瘤患者中已显示出令人印象深刻的临床反应[2]。美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA) 批准了两种靶向CD19CAR-T 治疗药：Yescarta™和Kymriah™用于复发性或难治性侵袭性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B 细胞淋巴瘤患者[3,4]。随着近年来实体肿瘤的发生率的升高，CAR-T 疗法在血液系统恶性肿瘤治疗方面的取得的成功使得越来越多的临床研究致力于将其扩大至实体瘤在内的其他癌症的治疗中。

1 嵌合抗原受体T 细胞(CAR-T)简介

嵌合抗原受体(CAR)是将识别肿瘤相关抗原(tumorassociated antigen，TAA)的单链抗体(singlechain variable fragment，scFv)和T 细胞的活化序列在体外进行基因重组形成重组质粒，转染至经纯化和大规模扩增的T 细胞，产生所谓的CAR-T 细胞。CAR-T 细胞能够以不依赖MHC 分子限制的方式识别肿瘤细胞上的特定靶标，诱导持久的抗肿瘤反应[5]。该特性也可有效防止肿瘤细胞通过下调MHC 的表达导致免疫逃逸的发生[6]。

通过不断探索和改善细胞内信号传导结构域的作用，已经产生了四代CAR-T 细胞。第一代CAR 仅包含一个细胞内信号传导域CD3ζ 以提供信号[7]。因此CAR-T 细胞活性差，体内存活时间短。第二代和第三代CAR 则在第一代CAR 基础上，分别合并一个或两个共刺激信号域如CD28 或4-1BB(CD137)[8]使得CART 细胞能够持续增殖，增强其抗肿瘤活性。第四代CART 细胞也称为“TRUCK”细胞，其加入了细胞因子或共刺激配体能够在肿瘤中分泌特定的细胞因子(如IL-12)，从而改变肿瘤的微环境并募集激活其他免疫细胞产生免疫应答[9]。CAR-T 细胞上的CAR 分子具有四个主要组成部分：抗原结合结构域，铰链区，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

1.1 抗原结合结构域

抗原结合结构域是CAR 的胞外部分，可识别靶抗原并相应地重定向表达CAR 分子的淋巴细胞的特异性。CAR 的抗原结合结构域由单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头连接成单链抗体(scFv)组成[10]。scFv 序列通常源自鼠或人单克隆抗体，也有利用固有缺乏轻链的骆驼科抗体重链可变区(VH)设计的单域抗体(纳米抗体)[11]。人scFv 噬菌体展示文库也是scFv 序列的一个来源[12]。

1.2 铰链区和跨膜结构域

CAR 分子的铰链区和跨膜结构域将细胞外抗原结合结构域连接至细胞内信号传导结构域。铰链区提供足够的柔韧性来克服空间位阻，且具有足够的长度以利于接近靶抗原。跨膜结构域通常利用如CD3ζ，CD28，CD4 或CD8α 等将CAR分子锚定在T 细胞膜上。CD3ζ 跨膜结构域介导CAR 二聚化并掺入内源性TCR 中，这可能有助于CAR-T 细胞活化[13]。

1.3 细胞内信号传导域

细胞内信号传导域通常包含一个激活域和一个或多个共刺激域，主要负责信号的活化和传导，是CAR-T 细胞发挥杀伤功能的“信号开关”。绝大多数CAR 分子通过CD3ζ 衍生的免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)激活CAR-T 细胞。带有CAR 的T 细胞除了激活结构域外还需含有共刺激结构域，研究最广泛的共刺激结构域为CD28 或4-1BB(CD137)，利用其设计的CAR T 细胞产品已获得FDA 批准[14]。

2 CART 在肿瘤中的应用

2.1 CART 在血液系统肿瘤中的应用

CD19 是目前CAR-T 免疫疗法中最具吸引力的靶标，表达CD19CAR 分子的T 细胞在血液系统恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果，其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL) 的完全缓解率高达90%，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL) 则高达60% 以上[15]。用于复发性或难治性侵袭性非霍奇金淋巴瘤患者的Yescarta™和用于急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B 细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)患者的Kymriah™已获美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准[3,4]。在Neelapu 等人[16]进行的II 期试验中招募了111 例B 细胞淋巴瘤患者接受抗CD19 CAR-T 细胞疗法，其客观反应率和完全缓解率分别为82% 和54%。除了ALL 和DLBCL 外，CAR-T 细胞在其他血液系统恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤的早期临床试验中也显示出了希望[17]。

2.2 CART 在实体瘤中的应用

在实体瘤中进行了许多临床前CAR-T 细胞免疫治疗试验，但其客观反应率不尽相同。在Hou 等[18]的一项针对262 例患者的荟萃分析表明：CAR-T 细胞疗法在实体瘤中的客观反应率为9%(95%CI：4%-16%)。Louis 等[19]在使用CAR-T 细胞治疗神经母细胞瘤中发现19 名患者中有4名(52.9%)达到了客观的临床反应，其中3 名甚至完全缓解。NCT01454596 研究中Goff 等人[20]利用抗EGFRvIII CAR-T细胞治疗淋巴结清扫术后复发的胶质母细胞瘤患者中1 例生存期达59 个月。Wick 等人[21]用抗EGFRvIII CAR-T 细胞治疗复发性胶质母细胞瘤患者，10 例患者中无人对此疗法有阳性反应(包括部分缓解或完全缓解)。在NCT03159819 研究中针对Claudin18.2 的CAR-T 细胞免疫疗法在12 例患者(5例胰腺癌，7 例胃癌)中有1 例完全缓解，3 例部分缓解[22]。在NCT02414269[23]研究中5 例间皮瘤或非小细胞肺癌胸膜转移患者在接受具有I-caspase-9 安全基因的抗间皮素CAR T 细胞联合抗PD-1 治疗后显示出部分缓解。在晚期胆管癌和胰腺癌中，Feng 等人[24]针对HER2 的CAR T 细胞进行的I期研究对11 例晚期HER2 +(＞ 50%)且接受了紫杉醇和环磷酰胺化疗预处理的患者进行1-2 个周期HER2CAR-T 细胞输注，1 例患者获得了部分缓解，5 例患者病情稳定。

3 CAR-T 在实体瘤应用中面临的挑战与解决方案

CD19CAR-T 在血液系统肿瘤中表现出令人印象深刻的临床反应，然而CAR-T 细胞在实体瘤应用中的客观反映率却不高。我们分析在使用CAR-T 细胞治疗实体瘤时，主要面临以下三个挑战：(1)缺乏特异性的抗原；(2)肿瘤的异质性；(3)肿瘤微环境的影响。

3.1 缺乏肿瘤特异性抗原

大多数实体瘤具有上皮起源，很难找到在肿瘤细胞表面上特异性表达而在正常上皮细胞中绝对不表达的肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)[18]。因此通常会找在肿瘤细胞上富集但在正常组织中也低水平表达肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA) 取而代之[25]。然而靶向TAA 的药物可产生靶上肿瘤外毒性，这限制了许多CAR T 细胞产品的临床应用。在一项针对靶向CAIXCAR-T 细胞临床试验中，多名肾细胞癌患者出现肝酶异常[26]。究其原因在于CAR-T 细胞渗透到表达CAIX 的胆管上皮中，且在随后给予抗CAIX 单克隆抗体后预防了该种情况的发生，从而提供了CAR T 细胞存在靶上肿瘤外毒性的有力证据。1 例在接受HER2CAR-T 细胞治疗转移性结肠癌的患者在细胞输注后15分钟出现呼吸窘迫和肺水肿，进展为多器官衰竭甚至死亡[27]。据推测，这种毒性的机制是通过CAR T 细胞识别在非恶性肺组织中表达的HER2 所致。解决CAR-T 细胞免疫治疗安全性的一种方法是利用肿瘤与非恶性组织之间抗原表达水平的差异而进行亲和力调整[28]。使用含较低亲和力scFv 的CAR分子可以靶向在肿瘤细胞上高表达而在非恶性细胞上低表达的抗原，从而确保只有具有高抗原密度的肿瘤细胞才能提供足够高的亲和力来激活CAR T 细胞[14]。另一种方案是使用多靶点CART 细胞减少CART 细胞对健康组织的结合[29]。

3.2 肿瘤异质性

患者的肿瘤并非全部表达相同的肿瘤相关抗原，实体瘤中CAR-T 细胞治疗的另一个挑战是高度的肿瘤异质性问题。解决肿瘤异质性的可行方法是使用基因工程技术设计靶向不同抗原的多价CAR-T 细胞。如共同靶向CD19 和HER2 的CAR T 细胞在体内显示出比具有单一靶标的CAR-T 细胞更大的抗肿瘤活性[30]。IL13Rα2 和HER2 特异性的scFv 共同形成双特异性CAR(TanCAR)可单独识别每种抗原以触发激活，且在遇到两种抗原时其功能会协同增强[31]。同样，共同靶向HER2，IL13Rα2 和EphA2 的三价CAR T 细胞也可有效清除肿瘤细胞[32]。另一种多靶点策略是使用柔性接头将识别CD3 的scFv与识别TAA 的scFv 连接起来，以形成分泌双特异性抗体(bispecific Tcell engagers, BiTEs)的CAR-T 细胞。相关研究已证实，在白血病和实体瘤的临床前模型中，分泌BiTE 的CAR-T细胞可有效克服抗原表达的异质性并避免抗原逃逸[33]。除此之外靶向与肿瘤异质性高度相关的癌症干细胞也是一种方案。CD133 是一种被证实在许多实体瘤中过表达的新型肿瘤干细胞标记物，已成为CAR-T 细胞免疫治疗研究的靶标之一[34]。

3.3 肿瘤微环境的影响

肿瘤微环境(Tumor microenvironment ,TME) 是一个复杂的肿瘤依赖性环境，主要由各种细胞外基质和基质细胞，炎性细胞和脉管系统组成。有研究发现实体瘤的TME 不仅限制了淋巴细胞的运输和进入实体瘤的整个质量，而且还下调了其在肿瘤部位的活性，扩增和持久性[35,36]。有研究表明CAR-T 细胞的局部或瘤内应用不仅可以在肿瘤部位发挥有效且持久的抗肿瘤功能、规避致密的细胞外基质、而且还可以降低脱靶引起的全身毒性反应的风险[37]。涉及阻断TME 中抑制性细胞Treg 细胞的分化、清除Treg、逆转Treg 细胞的免疫抑制作用等抗肿瘤治疗方法也成为了研究热点[1]。

CAR-T 细胞活化所需的免疫刺激性细胞因子在实体瘤微环境中通常被下调[38]。由于细胞因子疗法全身递送的毒性较大，目前已开发出几种基于基因编辑的策略来递送较高局部水平的关键细胞因子如IL-12，IL-15，IL-18 和IL-21 等来实现CAR T 细胞的活化[34]。然而免疫检查点和可溶性免疫抑制因子在实体瘤微环境中却高度上调，并会严重影响T细胞的增殖和功能[39]。将CAR-T 细胞与免疫检查点抑制剂联合应用是实体肿瘤的治疗的又一策略。目前NCT03726515研究正在进行抗EGFRvIII CAR-T 细胞与PD-1 抑制剂联合用于新诊断的胶质母细胞瘤的临床试验[34]。然而一些科学家认为，干预PD-1 基因在T 细胞中的表达将不利其存活，并反过来会促进幼稚T 细胞的进一步衰竭[40]。

另有一些研究[41,42]还发现一些microRNA 或者lncRNA 对免疫过程有影响或与之相关，而对于CART 细胞治疗也是如此。Ji 等人[43]的研究表明microRNA 可以抑制肿瘤细胞中的某些抑制分子间接增强CAR-T 的细胞毒性，因此使用包含microRNA的RNA 干扰技术是应对抑制性肿瘤微环境的的另一种选择。

4 展望与未来

CAR T 细胞免疫疗法应用于实体瘤开创了实体瘤免疫治疗的新范例。虽然增加CAR 设计的复杂性和T 细胞的基因编辑可能会放大CAR T 细胞治疗相关的风险，然而通过对基因编辑相关并发症的持续监控将有助于进一步发现有关的风险并寻找解决方案。相信在未来，通过基因编辑技术可以更加有效地改造CAR T 细胞，为实体瘤患者提供一种新的治疗选择。