表观遗传学在巨噬细胞骨免疫调节中的研究进展

刘旭琳，廖 娟

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 610072)

表观遗传是指基因序列不变，而基因表达发生可以遗传的改变。最新研究表明，多种表观遗传修饰影响巨噬细胞极化状态，从而实现骨免疫调控，但对于其详细机制还有待深入研究。本文针对表观遗传修饰在巨噬细胞骨免疫调控中的作用及其在牙周骨组织再生方面的研究进展予以综述。

1 表观遗传学

表观遗传学定义为在无DNA序列的改变的前提下，发生蛋白质表达的变化，并可以在细胞增殖和机体发育过程中稳定地传递，与多种病理生理过程具有密切联系[1]。表观遗传学是在研究与传统的遗传学不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的一门前沿学科，其调控方式主要包括：DNA甲基化、组蛋白乙酰化或甲基化、非编码RNA(ncRNAs)修饰等，各调控方式单独作用或相互影响。

2 巨噬细胞

2.1 巨噬细胞的不同极化状态及其生理作用巨噬细胞作为一种异质性固有免疫细胞，具有高度的可塑性，在一些关键转录因子及信号通路的作用下，可转变为促炎破骨M1型或抗炎成骨M2型以进行骨免疫调节，近年来在骨组织再生及组织工程领域受到了广泛关注。近年的新理论认为，巨噬细胞的极化及机体稳态条件下的骨组织改建都是通过转录因子、细胞因子、多种信号通路和表观遗传调节等多层系统交织而成的复杂网络共同调控的，其中表观遗传是重要的调控环节[2]。

2.2 巨噬细胞的骨免疫调节机制有学者指出，免疫系统和骨系统间存在着密不可分，其互相调控的交互机制被称为骨免疫。巨噬细胞的骨免疫调控受到多种调控系统的影响，如核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/核因子κB受体活化因子配体(receptor Activator of Nuclear Factor-κB ligand，RANKL)/骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)系统、WNT/β-连环蛋白信号通路。巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)、骨刺激因子等可调控成骨。

3 表观遗传修饰对巨噬细胞骨免疫的调控

3.1 DNA甲基化DNA甲基化是一种稳定的表观遗传修饰，是指胞嘧啶C-5位上增加或移除一个甲基。DNA甲基化对巨噬细胞的表观遗传学调控的研究还较少，目前仅DNMT3b、DNMT1已被证实参与到了巨噬细胞极化进程中。Yang等[3]研究表明肥胖小鼠DNMT3b异常表达，导致巨噬细胞向M2极化受限，从而导致慢性炎症，而DNMT3b敲除后呈现相反趋势。Cheng等[4]研究发现DNMT1引起细胞因子信号转导抑制蛋白1启动子甲基化水平升高，使其表达被抑制，促进巨噬细胞释放LPS诱导的促炎细胞因子，如TNF-α和IL-6的释放，以诱导其促炎表型。

3.2 组蛋白乙酰化染色质中的核小体重要组成成分组蛋白，可以被乙酰化或甲基化。值得关注的是，组蛋白乙酰转移酶(histone deacetylase，HDAC)对巨噬细胞表型的影响作用不同。DOU等[5]证明HDAC2是RANKL诱导破骨细胞形成的关键阳性调节因子：在破骨细胞形成过程中，骨髓巨噬细胞HDAC2表达升高，而通过慢病毒感染缺失HDAC2，则抑制骨吸收。相反地，HDAC7及HDAC9被证明抑制炎症性骨吸收。Stemig 等[6]证明小鼠破骨细胞中有条件的HDAC7的缺失可抑制转录因子MITF的活性，导致破骨细胞形成在体内增强，并与骨吸收增加相关，但该研究并未涉及其骨吸收的表观遗传学调控是否与巨噬细胞免疫调控有关。Li等[7]研究发现在慢性炎症条件下，HDAC9是牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)中受影响最严重的HDAC家族成员，miR-17通过抑制HDAC9诱导炎症环境下PDLSCs的成骨分化。由此看来，干预调控HDAC的表达有望成为通过巨噬细胞进行骨免疫调节的表观遗传学手段。

3.3 NcRNA随着基因组及转录组研究进展，曾被认为进化过程中累积的“垃圾序列”的ncRNAs，被越来越多的研究证实参与了基因调控。虽然ncRNA调节各种生物过程和人类疾病的机制仍然大部分未知，但是到目前为止人们已发现不少ncRNA，尤其是微小RNA(miRNAs)参与巨噬细胞极化调控[8]。Graff等[9]发现，巨噬细胞在受到LPS、IL-4等外界刺激时，miRNAs表达量会发生明显改变，相应的，过表达或抑制部分miRNAs后，也会调控巨噬细胞极化进程。目前已确认的促进M1型巨噬细胞极化的miRNA有miR155、let-7c、miR-125a-5p，促进M2型巨噬细胞极化的miRNAs有miR-223、miR-124、miR-146[9]。另外，一些miRNA被证实与炎症刺激下骨吸收相关，例如炎症刺激下破骨分化中表达上调的有miRNA-21、miRNA-31、miRNA-182、miRNA-148、miRNA-31、miRNA-378等，表达下调的有：miRNA-34a，miRNA-155、miRNA-150、miRNA-146a、miRNA-141、miRNA-34a、miRNA-223等[10～12]。长链非编码RNA(long noncoding rna，lncRNAs)在自身免疫性疾病及肿瘤领域的研究较多，其在免疫细胞发育、分化和活化的过程中广泛表达，既可以作为转录调节因子，也可以通过影响其它因子来调节免疫基因的表达，参与免疫调节[13]。目前已有LncRNA通过巨噬细胞对类风湿性关节炎免疫调控的研究，但尚缺乏其对巨噬细胞骨免疫调控的研究报道。

3.4 外泌体近年最新研究中，一种叫外泌体的脂质包裹体结构备受关注。外泌体是一种直径为30～100 nm，内部包裹蛋白、脂质以及miRNA、circRNA、lncRNA等遗传信息的膜性囊泡[14]。通过外泌体运输，细胞可将生物信息长距离传递至受体细胞并影响受体细胞功能，实现细胞间通信，但目前，在骨髓微环境中何种细胞可分泌携带成骨信号的外泌体，外泌体又如何实现不同细胞间的相互调控，仍需深入研究。骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)可通过外泌体将表观遗传信息转运至相应受体细胞。Liu 等[15]研究发现BMSCs来源的外泌体与破骨前体细胞—小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7混合，外泌体可随时间推移逐渐进入Raw264.7中，并促进Raw264.7分化为破骨细胞，证实BMSCs可通过外泌体促进破骨细胞的分化成熟。巨噬细胞吞噬人颌骨BMSCs来源的外泌体后，miR-223、miR-let-7c含量升高，促进巨噬细胞向M2型极化，减弱骨的炎性吸收，提高新骨形成[17]。

4 表观遗传学调控巨噬细胞免疫成骨在牙周骨组织再生方面的研究

4.1 口腔种植钛(Ti)及其合金是目前应用广泛的牙科植入材料。然而，种植体作为一种异物，植入后的修复过程也被视为机体对种植体的免疫反应过程，过度的宿主免疫反应常不利于早期种植体骨结合，从而影响种植成功率及长期稳定性。而巨噬细胞作为炎症早期固有免疫细胞，与种植体周围疾病息息相关。研究表明，当发生种植体周围疾病时，种植体周围黏膜中的巨噬细胞比例增大、功能活跃、表型易发生重编程，巨噬细胞极化同时也受种植体周围病原菌的影响，不同表型的巨噬细胞可引导种植体周围疾病向不同方向发展[16]。近年来，众多研究致力于钛种植体的表面修饰，试图通过种植体表面改性以调控巨噬细胞介导的骨免疫来实现更好的种植体周围骨结合。Lu等[17]研究发现Sr可以调节巨噬细胞的免疫反应，抑制IL-6的表达和产生骨形态发生蛋-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP2)，促进成骨。Zhao等[18]利用磷酸化学转化技术在钛植入物表面制备了钙-锶-锌-磷酸盐(calcium-strontium-zinc-phosphate，CSZP)涂层，该表面形貌和元素的修饰通过传递IL-4，在体内外均能诱导CSZP上的巨噬细胞M2极化，促进BMSCs成骨。然而，以上这些研究尚未将种植体表面材料对巨噬细胞骨免疫调控的影响与表观遗传学联系起来。

目前为止，巨噬细胞调控的种植体周围骨结合及种植体周围疾病的表观遗传机制研究得很少，且仅限于DNA甲基化和miRNAs，其证据仅来自少数临床前研究。例如，Daubert等[19]研究发现，从种植体周围龈沟液取样，测得种植体周围炎的样本中，整体DNA甲基化水平较正常组升高。因为种植体周围龈沟液中主要存在巨噬细胞及其炎性因子和上皮细胞及其分泌物，而巨噬细胞和上皮细胞内外都检测到有溶解的钛颗粒，故可能由于溶解的钛颗粒的存在，改变了巨噬细胞和上皮细胞的生存环境，从而改变了其DNA甲基化水平，导致其表型的改变。另外，有研究发现，种植体表面的钛颗粒脱落促使巨噬细胞向M1型极化不利于种植体周围骨愈合[20]。表观遗传可受环境影响而发生改变，而种植体表面材料为巨噬细胞提供的特殊环境将如何影响巨噬细胞的表观遗传状态，导致其表型发生怎样的改变，进而导致其对骨免疫调控发生怎样的影响仍需要更深入的探索。这也为种植体周围炎的研究提供了新的病因学思路和治疗靶点。

4.2 牙周炎过往研究认为来自牙周致病菌的内毒素、外毒素和酶是造成牙周炎患者牙周组织发生溶解、吸收的主要原因。然而随着研究的进一步深入，学者们发现单纯的菌群紊乱不足以引发严重的骨吸收。牙周致病菌感染后可引发宿主的固有免疫和适应性免疫应答，参与这一过程的免疫细胞、炎症因子及抗体等，才是造成牙周组织破坏的主要因素[21]。

近年来，相关的表观遗传学研究逐渐增多，DNA甲基化、组蛋白乙酰化及ncRNA相关研究均有报道。Jiang等[22]研究发现DNA甲基化状态的改变可能导致牙周炎进程中某些基因选择性地激活或沉默，进而导致细胞因子、趋化因子、信号分子、细胞外基质分子等蛋白质表达水平的改变，使局部微环境发生变化，从而影响包括巨噬细胞在内的免疫细胞的激活状态。另外，Cantle等[23]推测牙龈组织炎症诱导的巨噬细胞极化可能是加剧牙周组织破坏的原因，他们发现牙周炎患者的牙龈组织中HDAC 1、5、8、9的RNA表达水平上调。除此之外，有研究表明牙周炎中miR-128的升高通过巨噬细胞中P38信号通路减轻TNF-α的反应，通过促分裂原活化蛋白激酶的调控以调节内毒素耐受[24]。表观遗传药物在炎症受损的骨愈合中治疗用途的研究也有见报道，例如Chen等[25]发现n-甲基吡咯烷酮和n，n-二甲基乙酰胺可以保护BMSCs在成骨过程中免受TNF-α的不利影响。但该研究是以BMSCs为治疗靶点，目前尚未见以巨噬细胞为表观遗传学治疗靶点的药物研究报道。

4.3 口腔正畸正畸牙移动的过程中，正畸力可诱导与炎症单核细胞相关的系统免疫反应，使全身性炎症单核细胞在正畸力刺激下被招募到牙周组织中，从而实现压力侧的骨吸收和张力侧的骨再生，进而使牙齿移动到一个新的牙周位置[26]。在炎症微环境中，PDLSCs会不可逆地失去成骨潜能，这与炎症环境中炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α增高，经典Wnt通路和NF- κB通路高度活化有关。He等[27]研究发现正畸牙移动过程中，受力后的PDLSCs炎症因子表达增加，增殖能力增加，同时可促进M1型巨噬细胞的极化和趋化，此外M1与M2型巨噬细胞的比率可以影响正畸牙齿的移动以及正畸牙齿移动过程中的牙根吸收。近年来研究发现，在培养的PDLSCs中，miRNAs可能是机械敏感的，并在骨重建过程中作为关键的转录后调节因子出现[28]。Wei等[29]总结出在机械牵张力作用下的PDLSCs中被报道上调的miRNA有53种。其中miR-21及其功能靶标PDCD4参与了对细菌性病原体和LPS的先天免疫应答，且相关miRNA的表达对牙周组织中正畸力的响应呈剂量和时间依赖性[30]。另外，Alexander 等[31]发现，外源性树突状细胞的外泌体可转运至 miR-146a 缺乏小鼠的免疫细胞中，抑制LPS刺激后的IL-6和 TNF-α释放，减少炎性因子导致的骨吸收，这与树突状细胞的外泌体可在B细胞、T细胞及树突状细胞等免疫细胞中传递有关，巨噬细胞是否参与其中的免疫调控还有待研究。

5 小结与展望

综上所述，巨噬细胞通过不同的极化状态，在机体免疫系统参与骨稳态调节中发挥重要作用。表观遗传调控是机体各种生理病理过程中重要的基因表达调控方式，已经成为环境因素和基因转录调控之间的重要联系。其机制复杂多样，涉及的调节通路众多，尚未形成明确的理论体系。因为表观遗传修饰在真核生物中普遍存在，利用其在细胞核内的骨免疫调控是一种极具潜力的骨组织修复再生疗法。但由于表观遗传修饰种类纷繁复杂，机制尚不甚明了。DNA甲基化、组蛋白修饰及 ncRNAs 都可能通过单独或者相互作用的方式，参与到巨噬细胞骨免疫调节的表观遗传调控中，从而影响成骨与破骨之间的平衡。如何利用表观遗传学机制进行牙周骨组织免疫调控是骨组织工程中的一大难题。在口腔临床中涉及的问题主要包括：如何减少牙周炎造成的牙周组织丧失、有效促进种植体周围骨整合、减少种植体周围疾病的发生、控制正畸牙移动过程中的骨改建等。我们相信，今后随着生物信息学相关技术的迅速发展，表观遗传修饰方式及调控机制的不断揭示，将对骨免疫调节及骨组织工程起到巨大推动作用。