左归丸含药血清对阿尔茨海默病细胞模型雌激素受体表达的影响

刘宏 仲丽丽 于颖 张雨薇 杨婧 代巧妹 李冀

(1黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2黑龙江中医药大学附属第一医院)

阿尔茨海默病(AD)是一种不可逆转的神经退行性疾病〔1〕，在中医属于“痴呆”范畴，多发生于老年人，由气虚和肾虚所致，结合“肾脑相通”中医理论，补肾治疗AD存在一定的合理性〔2〕。左归丸是传统补肾阴药物〔3〕。据报道，左归丸可通过促进热休克蛋白的表达，抑制AD模型神经细胞的凋亡〔4〕，并且对 AD 大鼠海马和皮质神经元细胞使抗氧化能力增强〔5，6〕。本课题组前期实验发现左归丸可以改善脑缺血大鼠的记忆力〔7〕及提高大鼠脑内雌激素受体(ER)的表达，并且运用ER拮抗剂之后，左归丸的这种神经保护作用大部分消失〔8〕。因此，考虑左归丸对神经元的保护作用可能与下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)存在联系。本实验在稳定的AD细胞模型上，探讨左归丸对细胞存活的影响及对ER表达的影响。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 Aβ1～42小鼠单克隆抗体(吉尔生化)，左归丸，购自北京同仁堂药店。ER单克隆抗体(wanleibio)、活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase)3单克隆抗体(wanleibio)、羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(wanleibio)内参抗体 β-actin(wanleibio)、电化学发光(ECL)液(wanleibio)、大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞(PC12)(procell)。

1.2主要仪器 酶标仪(BIOTEK)、电热恒温培养箱(天津泰斯特)、凝胶成像系统(北京六一)超纯水系统(Heal Force 公司)、超速冷冻离心机(湖南湘仪)、CO2培养箱(上海力申)、超净工作台(苏州净化)、RPMI-1640培养基(Gibco)。

1.3药物配制 将5 mg Aβ1～42溶于28.3 μl的二甲基亚砜(DMSO)中，配成浓度为40 μmol/L的储存液，用超纯水稀释，分装保存。取100 μl的Aβ1～42置于37℃培养箱7 d，进行老化处理。

1.4分组 对照组、模型组、Aβ1～42+低浓度含药血清组(干预组1)、Aβ1～42+中浓度含药血清组(干预组2)、Aβ1～42+高浓度含药血清组(干预组3)。

1.5给药 正常培养PC12细胞，给予Aβ1～42(40 μmol/L)处理作为模型组，药物干预组分别给予低(3%)、中(5%)、高浓度(10%)的含药血清。

1.6MTT法检测细胞活力 分别将24 h、48 h、72 h细胞加入MTT染色液，酶标仪测定OD值。

1.7Western印迹法 检测含药血清干预前后细胞中雌激素受体(ER)、Cleaved-Caspase3蛋白的表达。Cleaved-Caspase3(1∶500稀释)4℃孵育12 h，目的分子量20 kD，ER1(1∶500稀释)，4℃12 h，目的分子量66 kD。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1MTT检测结果 与对照组比较，模型组细胞存活率显著下降(P<0.05)，与模型组比较，干预组1细胞存活率显著增加(P<0.05)；与干预组1比较，干预组2细胞存活率显著增加(P<0.05)；与干预组2比较，干预组3细胞存活率显著增加(P<0.05)。见表1。

2.2Cleaved-Caspase3表达情况 与对照组比较，模型组Cleaved-Caspase3表达显著增加(P<0.05)；与模型组比较，干预组1 Cleaved-Caspase3表达显著下降(P<0.05)；与干预组1比较，干预组2 Cleaved-Caspase3表达显著下降(P<0.05)；与干预组2比较，干预组3 Cleaved-Caspase3表达显著下降(P<0.05)，见表1、图1。

表1 各组细胞活力及Cleaved-Caspase3、ER1蛋白表达比较

2.3ER1表达情况 与对照组比较，模型组ER1表达显著下降(P<0.05)；与模型组比较，干预组1 ER1表达显著增加(P<0.05)；与干预组1比较，干预组2 ER1表达显著增加(P<0.05)；与干预组2比较，干预组3 ER1表达显著增加(P<0.05)，见表1、图1。

图1 Western印迹检测各组细胞Cleaved-Caspase3、ER1表达

3 讨 论

AD临床治疗常以补肾化痰、补肾开窍、补肾活血为常见的配方组合〔9，10〕，其中，补肾是关键。中医藏象学认为“肾主骨生髓通于脑”〔11〕，肾气充盈，头脑灵活，肾气亏虚，健忘智衰。本课题组从中医传统理论出发，认为老年痴呆的主要病机是肾气的缺损。肾虚导致脑无所养，脑衰健忘。故治疗当用补肾法〔12〕。有报道指出，左归丸对衰老小鼠AD模型有保护作用，通过抑制自由基生成保护神经元免受氧化损伤，防治AD〔13，14〕。临床观察发现，AD患者行穴位电针疗法配合加味左归丸治疗后，疗效确切，能显著提高患者的认知功能，提升其生活自理能力和生活质量〔15〕。王恩龙〔16〕用加味左归丸治疗老年性痴呆(AD)患者20例，取得一定疗效，并与用多奈哌齐片治疗的20例进行对照，结果显示二者疗效无显著差别。左归丸具有滋阴补肾、填精益髓之效，切合 AD 肾精不足、脑髓失养、 神机失用的关键病机。阴虚乃衰老之本，据报道左归丸治疗老年痴呆等老年性疾病，收效显著〔17，18〕。本研究AD细胞模型〔19〕的基础上，应用左归丸含药血清干预AD细胞。结果显示，与模型组较，左归丸含药血清对Aβ诱导的PC12细胞损伤有抑制作用，这与田旭升等〔20〕的研究一致。

细胞凋亡和自噬参与神经发育及神经系统对各种刺激的反应，细胞凋亡过多或自噬缺陷均与神经退行性变有关〔21〕。这两个过程可能协同或拮抗作用，类固醇激素受体是细胞凋亡和自噬的调节因子，但它们在各种病理过程中的作用是复杂的。一般来说，雌激素、孕酮和矿物皮质激素受体介导抗凋亡信号，而雄激素和糖皮质激素受体(GR)参与促凋亡途径〔22〕。研究表明，雌激素通过诱导海马和皮层神经元信号通路聚集在线粒体上，通过维持钙稳态、强化有氧糖酵解、持续和增强线粒体功能，促进有效的胆固醇转运和β淀粉样清除，对AD具有一定的治疗意义〔23〕。本实验结果表明，左归丸有可能通过上调ER的表达抑制AD细胞的凋亡。

综上，ER有可能是中医学“肾脑相关”的通路之一。中医学“肾通于脑”理论在现代医学中可能与多种分子机制有关，还需进一步探索。