ESTD术联合生物免疫疗法对老年食管癌患者疗效及循环肿瘤细胞的影响

李维青 李志田 张旭刚 李宝重 刘揆亮

(首都医科大学附属北京世纪坛医院 1胸外科，北京 100038；2消化科)

食管癌是全世界第八位最常见肿瘤，同时也是造成癌症患者死亡的常见原因，仅于2012年，大约有45万例食管癌新增患者，有40万例患者死于该病，而外科手术被认为是局限性食管癌患者的首选治疗方法〔1〕。研究发现〔2〕，隧道法内镜黏膜下剥离术(ESTD)可以通过内镜在食管黏膜下建立起固有肌层和黏膜层间的通道，封闭了消化管腔与其他腔隙，通过通道进行手术操作，并发症发生率低。生物免疫疗法可以通过抑制癌细胞的增殖及增强患者免疫力达到增强治疗效果的作用，是一种重要的肿瘤辅助治疗手段，然而有关该疗法在食管癌中应用的研究并不多见。循环肿瘤细胞(CTCs)已被证明是影响肿瘤患者预后的重要因素，可为癌症治疗提供新的策略，高CTC与肿瘤患者整体生存率差有关〔3〕。本研究探讨ESTD及ESTD联合生物免疫疗法对老年食管癌患者疗效及对CTCs的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 将首都医科大学附属北京世纪坛医院于2014年8月至2019年2月收治的117例老年食管癌患者作为研究对象，随机分为对照组(n=58)和观察组(n=59)。对照组男34例，女24例；年龄65～74岁，平均(69.27±1.40)岁；病变部位在颈段、胸上段、胸中段、胸下段的患者例数分别为8、11、32、7例。观察组男37例，女22例；年龄65～75岁，平均(69.48±1.32)岁；病变部位在颈段、胸上段、胸中段、胸下段的患者例数分别为6、10、28、15例。两组性别、年龄、肿瘤病灶的位置比较无统计学差异(P>0.05)，本研究已获取医院伦理委员会批准。纳入标准：患者均经病理学检查确诊为食管癌；临床资料完整；患者均具有手术指征；签署知情同意书。排除标准：合并有其他部位的恶性肿瘤；有心、肝等重要器官衰竭；患者及其家属配合度欠佳；合并精神异常者；合并有血液系统疾病。

1.2方法 对照组接受ESTD治疗，在患者麻醉成功后采用卢戈液确定病变的部位及范围，在肿瘤病灶边缘3～5 mm处进行标记，随后进行多点注射，形成局部隆起，应用一次性黏膜切开刀(Dualknife)沿事先做好的标志部位切开直至黏膜下层，经切口进入，将固有肌层和黏膜层分离，建立黏膜下隧道，内镜沿隧道两侧对病灶进行切除，直至完成整个病灶的切除，采用氩离子凝固术及热活检钳处理出血的小血管。术后给予患者抑酸、补液和营养支持等对症治疗。观察组接受ESTD联合生物免疫疗法治疗，手术方式同上，采集患者外周血100 ml，应用聚蔗糖(Ficoll)将外周血单个核细胞分离，洗涤、离心后进行培养，诱导树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的活化。将培养8～10 d的细胞通过离心、洗涤，并就部分细胞进行细菌感染的检测，确定满足细胞质量控制的要求后按照(6～8)×108/次的量将细胞溶于100 ml的生理盐水，在2 h之内将其回输至患者体内，1次/d，连续输入5次。

1.3临床疗效 根据实体瘤临床分级标准于治疗结束后对所有患者进行临床疗效评估，完全缓解(CR)是指病灶均消失，且在4 w之内无复发；部分缓解(PR)是指肿瘤病灶缩小超过50%，同时没有新的肿瘤病灶产生；稳定(SD)是指肿瘤病灶缩小面积在50%之内，增大量小于10%；进展(PD)是指病灶无缩小反而增大，增大面积超过10%，甚至有新病灶产生。将前两者规定为临床缓解。

1.4血清肿瘤标志物表达水平 在所有患者治疗前和治疗后采集患者肘静脉血约5 ml，离心获取血清，应用化学发光法就血清肿瘤相关细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、糖类抗原(CA)19-9水平进行测定。采用美国曼贝克曼发光免疫分析仪进行操作，试剂盒由北京科美生物技术有限公司提供。

1.5免疫功能指标 分别于治疗前、后采集患者肘静脉血约3 ml于抗凝管中，加入10 μl的CD3+、CD4+、CD8+抗体，避光孵育0.5 h后加200 μl的溶血素，避光放置15 min。待溶液变为透明后，加入1 ml的磷酸盐缓冲液(PBS)，离心，随后应用多聚甲醛溶液固定，检测外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞表达水平，并计算出对应的CD4+/CD8+，采用美国BD公司所生产的流式细胞仪及对应试剂进行操作。

1.6CTCs表达情况〔4〕于治疗前、后采集患者肘静脉血约5 ml，将红细胞去除后，使用Militenyi免疫磁珠将白细胞去除并富集上皮来源的细胞，对CTCs表达情况进行鉴定，采用免疫荧光染色技术进行鉴定。CTCs超过3个为判定标准。

1.7术后并发症 记录所有患者住院期间所发生的并发症，如：食管反流、发热等，并给予对症处理。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1两组临床疗效比较 对照组临床缓解率(70.69%，CR 22例、PR 19例、SD 13例、PD 4例)显著低于观察组(89.83%，CR 32例、PR 2例、SD 5例、PD 1例；χ2=6.779,P=0.009)。

2.2两组治疗前后血清肿瘤标志物水平比较 治疗前，两组血清Cyfra21-1、CEA、SCC、CA19-9表达水平无统计学差异(P>0.05)；治疗后，两组以上血清肿瘤标志物表达水平显著下降，观察组显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组治疗前后血清肿瘤标志物表达水平比较

2.3两组治疗前后免疫功能指标比较 治疗前，两组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平无统计学差异(P>0.05)；治疗前后两组CD8+比较无统计学差异(P>0.05)，治疗后，两组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表达水平显著下降，观察组显著高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组治疗前后T淋巴细胞亚群表达水平比较

2.4两组治疗前后CTCs表达比较 治疗前，两组CTCs阳性表达率无统计学差异(P>0.05)；治疗后，两组CTCs阳性表达率均下降，观察组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组治疗前后CTCs阳性表达率比较〔n(%)〕

2.5两组术后并发症比较 住院期间，对照组有4例(6.90%)患者发生术后并发症，2例为食管反流，1例为发热，1例为创口感染；观察组有6例(10.17%)患者发生术后并发症，3例为食管反流，3例为发热。两组术后并发症发生率无统计学差异(P>0.05)。经抗感染等对症支持治疗，患者均逐渐恢复。

3 讨 论

对于中晚期食管癌患者的治疗以非手术方法包括放射疗法和联合治疗为主，尽管在过去的几十年间，食管癌的放射治疗和外科诊断技术都取得了实质性进展，晚期食管癌患者的预后仍然很差，目前认为，肿瘤进展通常伴有免疫功能差，患者免疫系统功能在影响肿瘤的疗效方面具有重要作用，而T细胞免疫功能减弱导致患者的免疫反应发生变化可能是造成食管癌预后差的关键性因素〔5,6〕。生物免疫疗法是肿瘤治疗过程中的重要辅助治疗方法，有助于改善肿瘤患者炎症反应状态，提高患者免疫功能〔7〕。

Cyfra21-1是上皮细胞角蛋白19片段中的可识别部分，存在于恶性肿瘤细胞的细胞质中，构成了食管癌肿瘤细胞骨架，在食管癌进展过程中，上皮细胞角蛋白在酶的作用下发生降解，通过外分泌释放入血，引起Cyfra21-1的表达水平升高；CEA是消化道肿瘤的常见的肿瘤标志物，同时也是一种可溶性蛋白复合体，发生肿瘤时，组织间连接的破坏及肿瘤细胞表面抗原附着力的改变会造成相关抗原释放入血，CEA表达量升高；SCC可作为诊断食管鳞癌的指标；CA19-9属于糖蛋白超家族成员，可随着肿瘤细胞的异常分化产生量增加，并在食管癌细胞死亡后释放入血〔8,9〕。以上血清学指标均可伴随着食管癌的进展过程而发生改变。

ESTD与传统的内镜下黏膜剥离术(ESD)相比具有许多技术优势，包括：可以通过在黏膜层和肌层之间形成黏膜下隧道来切除黏膜病变，随后治疗性内窥镜可以进入隧道并获得清晰的手术视图，手术中注入的二氧化碳可以帮助钝性解剖黏膜层，减少黏膜下注射次数，缩短手术时间，提高切除速度，减少肌层损伤等，可以更彻底地切割黏膜下层，从而降低肿瘤转移和复发的风险〔10,11〕。而生物免疫疗法中DC细胞具有摄取、加工和呈递抗原的作用，可以促使T细胞的活化；而CIK细胞则具有杀伤肿瘤细胞的作用，回输 DC和CIK细胞有助于对恶性肿瘤的治疗〔12〕。因此，ESTD术联合生物免疫疗法对食管癌患者的治疗效果更好，也更能促使高表达的血清肿瘤标志物水平的恢复。

CTCs是离开原发肿瘤部位并进入血流的肿瘤细胞，可以扩散到其他器官，而肿瘤的复发和转移可能是由CTCs引发的临床隐匿性微小残留病灶引起的，CTCs可能具有转移的潜力，其对肿瘤预后的评判价值已在多种肿瘤中得到证实，一项meta分析结果也肯定了CTCs在监测食管癌患者的复发和预后中的作用〔13〕。本研究结果提示联合治疗方案对降低CTCs阳性率有较好的效果，这可能与观察组加用了生物免疫疗法，生物免疫疗法中DC的回输可促使处于静止状态的T淋巴细胞被激活，激活免疫系统，促使机体免疫应答反应；CIK细胞的杀伤活性水平较高，且并不会被T细胞受体所影响，具有显著的抗肿瘤作用〔14～16〕，DC-CIK疗法可改善肿瘤患者免疫功能，增强治疗效果有关。翟军厚等〔17〕指出，生物免疫疗法的应用可有效降低外周血CTCs水平，与本研究结果一致。而两组术后并发症发生率的比较提示生物免疫疗法的应用安全可靠，并不会显著增加不良反应的发生。

综上所述，ESTD联合生物免疫疗法对老年食管癌患者治疗效果确切，可有效降低CTCs、血清肿瘤标志物水平，改善患者免疫功能。