长链非编码LncRNA Malat1在糖尿病肾病患者血清中的表达及临床意义

周连吉 吴标良 杨大伟 王民登 郭星荣 欧丽娜

(右江民族医学院附属医院内分泌科，广西 百色 533000)

目前糖尿病肾病(DKD)已成为中国慢性肾脏疾病的第一病因。在过去的二十年中，DKD的发病率和死亡率在世界范围内迅速上升〔1，2〕，最新的流行病学数据显示，DKD已经成为城市人群进入透析的终末期肾病的第一病因〔3～5〕。长链非编码RNA在各种细胞反应、发育和疾病过程中起着重要的调节作用〔6〕，研究证实〔7〕，长链非编码RNA不仅参与了DKD中肾组织纤维化和细胞外基质沉积，而且还参与了氧化应激、炎症反应和肾小管上皮细胞的调亡等过程。其通过一系列机制参与了DKD的发生与发展。MALAT1又称为非编码核内富含转录物(NEAT)2，由Ji等〔8〕于2003年在非小细胞肺癌研究中发现，是哺乳动物体内高度保守的长链非编码RNA(LncRNA)之一。研究表明，MALAT1是最早发现的LncRNA之一，在高糖培养条件下，其在视网膜内皮细胞和糖尿病小鼠视网膜中显著上调〔9，10〕，LncRNA MALAT1在糖尿病引起的微血管并发症如DKD和糖尿病视网膜病变中调节炎症反应〔11～13〕。本研究主要探讨LncRNA MALAT1在DKD患者中的作用及可能的发病机制，有助于寻找可靠的生物标记和治疗新靶点。

1 对象和方法

1.1研究对象 2017年1月至2017年12月收集在右江民族医学院附属医院就诊的47例糖尿病患者，20例2型糖尿病(T2DM)患者，其中男12例，女8例，平均年龄(54.85±14.24)岁。27例DKD，其中男16例，女11例，平均年龄(56.3±12.67)岁。同时收集于医院体检中心就诊的14例非糖尿病健康者作为对照组，其中男8例，女6例，平均年龄(49.57±12.54)岁。T2DM组、DKD组及对照组之间性别、年龄等一般情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。DKD组入组条件：符合中国TG2DM防治指南2019年版DKD诊断标准〔14〕。T2DM组入组条件：①符合1999年世界卫生组织WHO公布的糖尿病诊断标准。②排除、感染、传染性疾病、肿瘤、药物等影响血糖或尿蛋白其他重大疾病。医院伦理委员会批准了该方案，每位患者在入组前均提供书面知情同意书。

1.2研究方法 收集所有研究对象的外周血液、尿液标本，收集身高、体重、血压、心率等基本资料，并计算体重指数(BMI)。超氧化物歧化酶(SOD)、血肌酐(Cr)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂等生化指标使用迈瑞BS-2000M(中国，深圳)全自动生化仪进行检测，胰岛素测定使用磁微粒化学发光仪(安图生)进行检测，尿微量白蛋白尿肌酐(ACR)、尿β2-微球蛋白(MG)、尿α1-MG等使用BA400特种蛋白仪(西班牙，Bio Systems公司)进行检测，检测均由医院受过专业培训的技术人员进行。口服葡萄糖耐量试验于次日8点在空腹状态下开始进行，将75 g无水葡萄糖溶入200～300 ml温开水中，于5 min内饮完，随即开始采血，并立即送检标本。所有单位均换算为国际标准单位。

受试者均行尿β2-MG、尿α1-MG、尿微量白蛋白(UMA)、尿肌酐(UCR)检测，并计算ACR。次日清晨在受检者空腹状态下收集受检者5 ml的中段尿液标本，10 min 3 000 r/min离心处理，取上清液，通过使用BA400特种蛋白仪对标本内UMA和UCR行免疫比浊法检测，并计算ACR。ACR<3 mg/g为正常，≥3 mg/g为异常；尿β2-MG<0.3 mg/L为正常，≥0.3 mg/L为异常；尿α1-MG<30 mg/L为正常，≥30 mg/L为异常。血肌酐水平正常值：50～106 μmol/L。

1.3Real-time PCR分析LncRNA MALAT1的表达水平 所有研究对象抽取5 ml静脉血，加入9 ml红细胞裂解液，混匀后使用超低温离心机，于4℃下2 500转离心5 min，弃上清，加入1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，提取好的白细胞于-80℃下进行保存。应用Trizol 试剂盒(普飞，中国上海)抽提白细胞中的总RNA。将提取的总RNA，参照Promega M-MLV 试剂盒(锐博生物，中国广州)进行反转录，反转录引物购自中国锐博生物有限责任公司。引物序列：MALAT1上游5′-CAGACCACCACAGGTTTACAG-3′、下游5′-AGACCATCCCAAAATGCTTCA-3′；GADPH上游5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA- 3′。以上操作均严格按照试剂说明书进行操作。PCR分析采用 SYBR Green (TIANGEN Bio，Beijing，China)有限公司产品。PCR条件：95℃ 15 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 20 s×40个循环。PCR使用熔解曲线评估。每个样本设置3个平行样，取3个样本的平均值。以 2-ΔΔCt值表示LncRNA MALAT1的表达水平。

1.4统计方法 采用SPSS25.0软件进行t及χ2检验受试者工作特征(ROC)曲线、Pearson线性回归法。

2 结 果

2.13组一般临床资料对比 三组BMI、ACR、尿β2-MG、低密度脂蛋白及三酰甘油比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；而尿α1-MG、Cr、肾小球滤过率(EGFR)、SOD、HbA1c，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.23组LncRNA MALAT1的表达水平在比较 与对照组(1.370±0.467)比较，LncRNA MALAT1在T2DM组(2.879±1.435)、DKD组(4.117±1.755)中的表达水平明显升高(P<0.001)；LncRNA MALAT1在DKD组中的表达较T2DM组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3LncRNA MALAT1在损伤肾小管标志物的表达 α1-MG正常组和α1-MG异常组LncRNA MALAT1表达分别为：3.942±1.564、2.644±1.836。LncRNA MALAT1在β2-MG异常的糖尿病患者血清中的表达较尿β2-MG正常的糖尿病患者明显升高，差异具有统计学意义(3.548±1.868 vs 2.035±1.359；t=3.55，P<0.05)。LncRNA MALAT1在ACR异常的糖尿病患者血清中的表达较ACR正常的糖尿病患者明显升高，差异具有统计学意义(3.836±1.804 vs 2.001±1.343；t=2.11，P<0.05)。

表1 3组一般临床资料对比

2.4LncRNA MALAT1的表达与糖尿病患者的SOD、ACR、尿β2-MG、尿α1-MG、Cr、HbA1c的相关性 LncRNA MALAT1的表达与ACR、尿β2-MG、尿α1-MG、Cr、HbA1c呈正相关关系(r=0.395、0.470、0.350、0.306、0.320；P<0.01，P<0.001，P<0.05)；而与SOD呈负相关关系(r=-0.388,P<0.05)。

2.5ROC曲线分析LncRNA MALAT1对DKD的标记物潜能 首先采用ROC曲线分析LncRNA MALAT1在DKD组和 T2MD组中，其作为DKD患者血清标志物的潜能。分析结果发现，ROC曲线下面积(AUC)为0.727(95%CI：0.586～0.868，P<0.05)，敏感度：53.6%，特异性：90.0%；进一步分析LncRNA MALAT1在DKD组和健康对照组中，其作为DKD患者血清标志物的潜能，分析结果发现AUC为0.952(95%CI：0.894～1.000，P<0.001)，敏感度：82.1%，特异性：100.0%，可知，LncRNA MALAT1的表达对DKD有一定的预测价值。

3 讨 论

糖尿病是与肾脏、视网膜、神经病变等各种并发症相关的慢性代谢性疾病，到2030年，全球约有3.66亿糖尿病患者，预计到2035年，全球约有5.92亿糖尿病患者，占总人口的1/10〔15，16〕。DKD是一种长期存在且控制不佳的糖尿病的常见并发症〔17～19〕，我国20%～40%的糖尿病患者合并DKD，现已成为慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因〔3，20〕。尽管DKD的分子机制并没有完全明确，但是随着研究的不断深入，越来越多的证据表明发病机制中的关键是遗传调节。许多研究证据表明lncRNA在各类疾病中起到的关键作用〔21〕。研究证实MALAT1失调参与了DKD的进展，其具有诊断靶点的价值意义。

本研究发现LncRNA MALAT1在T2DM及DKD患者中的表达较健康对照组明显升高，这与Zhang等〔22〕的研究报告是一致的。DKD患者进展缓慢，DKD早期主要表现为肾脏的体积增大及肾小球滤过率(GFR)的增加，而没有任何的临床症状〔23～26〕，但是随着病情的进展，DKD患者肾小球滤过压增高并且伴有滤过膜电荷屏障受损，此时患者尿中将会出现UMA，但病人的GFR仍处在正常范围之内，也不会出现相关的临床症状，仅表现出UMA的异常。目前，UMA是早期DKD实验室诊断的重要依据，而临床通过ACR来矫正随机UMA的波动。本研究结果说明LncRNA MALAT1在肾脏受损上发挥作用，在Li等〔27〕研究发现，在DKD中，MALAT1和miR-23c及其靶基因焦磷酸化相关蛋白胚胎致死性异常视觉样蛋白(ELAVL)1在焦磷酸化细胞死亡的信号传导途径中起潜在作用。在高血糖条件下LncRNA MALAT1的表达水平增加，荧光素酶测定证实，MALAT1是miR-23c的靶基因，因此，miR-23c在细胞中的表达下降，焦磷酸化相关蛋白ELAVL1和NOD样受体蛋白(NLRP3)炎症小体的表达上调，随后激活半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-1，促进促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18的分泌，从而促进炎症反应。相反地，MALAT1的表达下调或miR-23c的表达上调诱导了ELAVL1的表达被阻断，从而抑制焦磷酸化途径并调节DKD的发生发展。

活化氧的大量生成及氧化应激反应的过度激活是DKD患者病情发展变化过程中重要的病理变化〔28〕。SOD是一种抗氧化物酶，可催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧，从而维持体内自由基的平衡〔29〕。研究表明，在糖尿病的情况下，SOD 表达水平的下降会增强体内过氧化物的含量，使肾小球微系统增强过氧化物引起细胞毒性作用，从而导致糖尿病肾脏细胞的损害〔30〕。SOD 的表达水平与肾功能损伤程度呈负相关，表明 SOD 在DKD不同阶段的发展中具有重要意义，可作为动态监测DKD发展的敏感指标。

本研究结果提示LncRNA MALAT1的高表达与T2DM患者DKD的发生发展有关，有望成为预测DKD患者预后的生物标志物。本研究首次报道了LncRNA MALAT1在DKD患者血清中高表达，其表达与ACR、尿β2-MG、尿α1-MG、Cr相关，本研究将进一步丰富DKD的发病机制，为DKD靶基因治疗提供新的靶点，为寻找DKD诊断及预后的生物学标志物的研究提供依据，为解决临床棘手的DKD提供新策略。但是影响DKD的因素很多，其具体的发病机制、诊断和预后疗效评估仍需进一步深入研究。