山羊p300基因生物信息学分析及其在主要器官中的表达

李晓璇，童旭,2，张丹丹,2，张冰，申屠璐燕,2，孙梦娟,2，齐昕,2，宁伟,2，张运海,2，曹祖兵,2*

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036； 2.地方畜禽遗传资源保护与生物育种安徽省重点实验室，安徽 合肥 230036)

山羊是最早被驯化的家畜之一，其繁殖力高、适应性强。近年来，我国山羊饲养业蓬勃发展，其中乳用型山羊可以提供高质量高品质的奶制品，肉用型山羊可以提供优质羊肉，绒用型山羊则可以提供优良的绒产品。近年来，随着人民生活水平的逐步提高，对肉用型山羊的需求量日益增加，这就需要提高肉用型山羊的生产力。同时，在提高肉用型山羊生产力的过程中，必须确保山羊的正常生长发育，这样才能获得更多数量的肉用型山羊。

与山羊生长发育的相关基因有很多，其作用也各不相同[1]。比如：KDM6 A基因会调节生育力、成骨分化和骨骼发育不良[2-5]；FGF10基因在调节山羊肌肉前脂肪细胞的成脂分化中起重要作用，最终会影响羊肉的品质[6]。p300又称EP300或KAT3B，因其相对分子质量约300 ku，故命名为p300[7]，其结构中含有组蛋白乙酰化区，具有乙酰化活性，可作为一类组蛋白乙酰基转移酶，能乙酰化4种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4。此外，p300还是重要的转录激活因子，参与调控基因的表达和介导转录因子之间的相互作用，在多个组织器官的生长发育中都起到重要作用。目前，p300基因在山羊中的基因结构信息与不同器官中的表达尚不清楚。因此，了解p300在山羊中的基因结构和不同器官中的表达有重要的生物学意义。本次试验主要材料为胎羊8种不同器官，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测p300基因在胎羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、卵巢和小肠8种器官中的表达量，为探讨p300在不同器官中的作用和调控机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

购买了安徽省淮南市临淮农牧有限公司的三月龄山羊，分别采集心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、睾丸、卵巢、小肠等器官。

1.2 采集胎羊器官样品

采样前务必将所用的器械进行消毒处理，并准备好采样过程所用到的材料试剂等。首先将器官分成适当大小的样品并在生理盐水中清洗，待清洗干净后用锡箔纸包裹住并做好标记然后放入液氮中，最后放在-80 ℃冰箱保存。

1.3 研磨胎羊器官样品

首先将研杵和药匙分别放入添加适量液氮的研体中预冷，然后从-80 ℃冰箱取出保存的器官样品并放入研钵研磨，在研磨过程中要不断地加液氮，必须保证液氮刚好没过样品。最后，当研磨好的样品呈粉末状时，将该样品放入已提前预冷好的冻存管中，加1 mL RNA-solv Reagent吹打混匀，标好器官样品名称和日期。

1.4 提取器官RNA和反转录

采用OMEGA试剂盒(R6934-01，美国)依次提取心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、睾丸、卵巢、小肠8种器官的RNA，试验操作流程参考试剂盒说明书。然后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，最后用NanoDrop 2 000分光光度检测8种器官RNA的浓度。将提取好的RNA样品用TRANS公司(AE311-03，中国北京)的反转录试剂盒进行反转录，反转录体系如下：Total RNA或mRNA 500 ng；Anchored Oligo(dT) 18 Primer 1.0 μL；2×TS Reaction Mix 10 μL；EasyScript®RT/Enzyme Mix 1.0 μL；gDNA Remover 1.0 μL； RNase-free Water to 6.5 μL。将上述反应体系混匀后放在4 ℃ 13 523g(转子型号：FA-45-24-11，5424/5424R)离心3 min，再置于PCR仪中42 ℃孵育30 min，95 ℃加热3 min，4 ℃ 终止反应，将cDNA放在-20 ℃保存。

1.5 p300基因引物设计与验证

通过NCBI官网查找山羊p300基因CDS序列并设计出3对引物，引物序列信息如下：

p300-1-F：5′-GTTACGGCAGGCACTAATG-3′，p300- 1-R：5′-GTGTCTAACTTCCTCTTGATGG-3′(引物p300-1扩增产物大小为165 bp)；p300-2-F：5′-GAGGAGGAGGAGCGGAAG-3′，p300-2-R：5′-CTG TGAGAGGTCGTTGGATAC-3′(引物p300-2扩增产物大小为180 bp)；p300-3-F：5′-AACAAGCCTTA CAGAACCTC-3′，p300-3-R：5′-ATGAACGCAGCCA ATAGC-3′(引物p300-3扩增产物大小为112 bp)。

首先从上海生工订购设计好的3条引物，然后按说明书进行引物稀释，接着配制下述的PCR反应体系。PCR扩增条件为：94 ℃ 预变性30 min；98 ℃ 变性10 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30～35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 终止反应。

接着，配制3% 琼脂糖和PCR反应体系：2×PremixTaq7.5 μL，Primer 1 0.5 μL，Primer 2 0.5 μL，Template cDNA 1.5 μL，灭菌水5 μL。再依次点样、电泳跑胶，用全自动凝胶成像仪进行成像，并分析产物大小是否符合要求。

1.6 荧光定量PCR

采用定量试剂盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，Vazyme，中国南京)，配置如下反应体系：2×SYBR GREEN 7.5 μL，Dye 1 0.3 μL，cDNA 1.5 μL，Primer 1 μL，RNase-free water 4.7 μL。一般3个复孔作为技术重复，根据需求适当扩大体系，混匀后加到八连管中，盖上管盖，置于定量PCR仪器中，反应条件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，后两步循环数为40。

1.7 山羊p300基因生物信息学分析

通过NCBI官网查找山羊p300基因的生物信息，包含外显子个数、染色体定位、跨越长度、mRNA长度、CDS长度、编码氨基酸个数和p300基因的结构，从而得到山羊p300基因序列的分析结果。接着，通过NCBI官网查找多个物种p300基因CDS和AA序列，利用DNAMAN软件比较p300基因在多个物种间的同源性。最后，利用软件MEGA分别添加多个物种的CDS和AA序列，分析得到p300基因在各物种中的进化关系。

2 结果与分析

2.1 山羊p300基因生物信息学分析结果

2.1.1 山羊p300基因结构

通过对山羊p300基因结构进行分析，发现其包含31个外显子，定位在5号染色体，跨越长度63 766 bp，mRNA总长9 571 bp，CDS全长7 235 bp，编码2 411个氨基酸(图1)。

图1 山羊p300基因结构

2.1.2 比较p300在山羊和各物种同源性

利用DNAMAN比对山羊和绵羊、牛、猪、马、黑猩猩、人、小鼠、大鼠p300基因序列，结果在核苷酸水平上，同源性依次为99.3%、97.97%、92.34%、91.65%、90.08%、89.22%、87.37、86.56%；在氨基酸水平上，同源性依次为99.54%、98.84%、96.2%、95.93%、94.63%、93.64%、92.98%、91.66%。p300基因在山羊和绵羊、牛、猪、马、黑猩猩、人、小鼠、大鼠保守性都较高，其中山羊和绵羊的保守性最高。

2.1.3p300在不同物种间的进化关系

分别从核苷酸水平和氨基酸水平比较p300在不同物种间的进化关系，结果显示：在核苷酸水平上，绵羊和山羊的进化关系最近，说明二者的亲缘关系比较近，其次和猪、牛、马的进化关系比较相近。而在氨基酸水平，山羊和绵羊的进化关系最近，说明二者的亲缘关系比较近，其次和猪、牛的进化关系比较相近(图2、图3)。

图2 p300在不同物种间的进化关系(CDS)

图3 p300在不同物种间的进化关系(AA)

2.2 RNA完整性和浓度测定结果

将8种不同器官的RNA进行琼脂糖凝胶电泳、成像，结果显示，8种不同器官均清晰地出现28S和18S这两个条带，说明8种不同器官的RNA完整性均较好，均未出现降解现象，可以进行后续实验(图4)。

图4 各器官RNA琼脂糖凝胶电泳图

同时检测了心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢和小肠8种不同器官RNA的浓度、D260/D280和D260/D230，结果如表1所示。

表1 8种器官RNA浓度

2.3 引物验证结果

琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。

如图6所示，分别是针对山羊基因p300设计的3条引物的实时荧光定量PCR熔解曲线，3条熔解曲线均为单峰，无多峰出现。

Marker—DNA分子标记；1—p300-1 PCR产物；2—p300-2 PCR产物；3—p300-3 PCR产物。图5 琼脂糖凝胶电泳图

图6 实时荧光定量PCR熔解曲线

结合琼脂糖凝胶电泳图和荧光定量PCR的实验结果可知，针对p300基因设计的第一条引物产物大小符合预期数值，且熔解曲线是单峰，说明引物特异性较好。因此，在后续的实验中我们选用第一个引物。

2.4 p300在胎羊主要器官中的表达谱

利用SPSS Statistics 17.0、Microsoft Excel分析定量结果并制作出p300在胎羊8种主要器官中表达谱。由实验结果(图7)可知，山羊p300基因在心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢和小肠中均表达，其中山羊p300基因表达量最高的是心脏，其次是小肠，接着是肾、卵巢和睾丸，最后是肝、肺和脾。

不同数据上没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图7 p300在胎羊8种主要器官中的表达量

3 讨论

本试验结果表明，山羊p300基因定位于5号染色体，包含31个外显子，跨越长度63 766 bp，mRNA总长9 571 bp，CDS全长7 235 bp，编码2 411个氨基酸。此外，p300在物种间保守性较高，其中山羊与绵羊同源性最高。通过比对山羊、绵羊和猪等8个物种p300基因结构，发现该基因所含外显子、mRNA、CDS等并不完全一致。但是，比对山羊和绵羊这两个物种的CDS和AA序列发现，p300基因的同源性和保守性均最高，说明物种之间的亲缘关系最近，这可能由于山羊和绵羊的进化速度和程度比较一致，生物相似程度比较高。

本试验结果表明，p300在山羊8种主要器官中均有表达，且表达存在差异性，其中心脏的表达量最高。以往研究表明，p300在雄性大鼠的心肌、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸等器官中均有表达，其表达也具有差异性。可见，p300基因在山羊和雄性大鼠主要器官中的表达比较相似[8]。又有研究表明，p300一个等位基因的缺失会引起胚胎或新生儿的死亡[9]，表明p300对于胚胎发育以及新生儿的生长发育有着至关重要的作用，因此，研究p300基因对于动物生长发育有重要意义。目前，大多科学研究的动物模型是大鼠或小鼠，对其生长发育的研究也比较多、比较全面。因此，可以借鉴p300对大鼠生长发育的研究，进而研究p300对山羊生长发育的影响。本试验发现，p300在山羊心脏中的表达量较高。而已有的研究表明，p300是心脏发育的一个重要组成部分，会参与心脏的形成、转录和发育[10]，且发生在小鼠心脏发育早期，这表明p300可能在胚胎心脏发育中发挥重要作用。有研究表明，p300会介导组蛋白H3K9乙酰化，从而参与调控GATA4在小鼠胚胎心脏发育中的时序表达[10-11]；p300是病理性左室肥大向心力衰竭的关键，会在心肌肥厚和心力衰竭中发挥重要作用[11]；特别是p300特异性抑制剂会缓解高血压引起的左心室肥厚、心肌纤维化和舒张功能障碍[12]。p300还可能在心脏调节室间隔缺损中发挥重要作用[13]，同时还会与心脏相关的基因相互作用，从而影响心脏发育和调控一些心脏疾病[14-15]。比如：Bnip3通过促进p300乙酰转移酶活性和选择转录因子来调控心脏基因表达，可能还会影响心肌细胞形态[16]。因此，可以在本试验的基础上进一步深入研究p300是如何影响和调控心脏的生长发育，为促进动物健康生长发育提供一个新方向。此外，还有研究表明ICAM-1的上调常与肺炎症和肺部疾病有关，而凝血酶会通过激活p300从而诱导人肺上皮细胞中ICAM-1的表达[17]，这为解决肺部疾病提供了新的解决思路和方法。p300基因多态性还与糖尿病、肾病的发生密切相关，参与促进Ⅱ型糖尿病患者的蛋白尿[18]，这为糖尿病的治疗也提供新的研究思路。虽然，本试验结果显示，p300在肾组织中的表达量不是很高，但相关研究表明，p300对于肾正常的生长发育至关重要。因此，可以在本试验的基础上进一步深入研究p300是如何影响和调控肾的生长发育，为促进动物健康生长发育提供一个新方向。

综上所述，p300在胎羊的心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、睾丸、卵巢、小肠等8种主要器官中均有表达，且表达具有差异性。其中，p300在胎羊心脏中表达最高，而p300与心脏生长发育密切相关，后续可以从p300调控心脏生长发育方面进行深入研究，揭示p300调控心脏生长发育的机制，为保证山羊正常生长发育提供重要的理论依据。