丝素蛋白负电性增强改性及其对降钙素基因相关肽的加载能力

宋广州，涂芳芳，丁梦瑶，戴梦男，殷 音，董凤林，王建南,4

(1. 苏州大学 现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123；2. 苏州大学医学部，江苏 苏州 215123；3. 苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006；4. 苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215123)

蚕丝是由蚕的绢丝腺合成与分泌并由吐丝口牵引而成的纤维，蛋白纯度高，不含有毒成分，未接触化学试剂。家蚕蚕丝有别于长期接触外界环境的羊毛等蛋白质纤维，是居家生活最具舒适亲和感的纺织原料。此外，近20多年来，基于蚕丝优质的蛋白质，家蚕丝素纤维/蚕丝织物、再生丝素蛋白和丝胶蛋白在生物医用材料领域的应用研究越来越受到关注，尤其是丝素蛋白(SF)。家蚕SF大分子由重链(H链)、 轻链(L链)和一种糖蛋白P25链以量比为6∶6∶1组成，H链占总分子量的92%，由12个疏水性的GAGAGS六肽为主的重复序列和11个亲水性的非重复序列相间排列而成[1]，独特的序列结构可使再生SF在外在因素(温度、溶剂、交联剂)的诱导下形成稳定结晶结构的丝素膜、三维支架或纳微球等生物医用材料[2]。

SF具有优异的生物相容性，支持角膜细胞[3]、成纤细胞[4]、血管细胞[5]、干细胞[6]等多种细胞的粘附、增殖或分化。SF在皮肤[7]、神经导管[8]、软骨[9]及血管[10-11]等组织工程支架方面的应用研究很活跃。其中，研究者对蚕丝织物、再生SF纳米纤维、再生SF多孔材料用于血管组织工程支架的构建开展了深入的研究。但作为血管组织工程支架，小直径(内径<6 mm)血管移植物还未实现临床应用，主要原因是易诱发血栓形成和内膜增生，管腔内径小而发生闭塞。血管内膜是维持凝血系统平衡的承担者，只有通过抑制平滑肌细胞过度增殖才能阻止内膜增生。现有研究指出，二维或三维SF材料可促进血管内皮细胞的生长，支持血管内皮细胞、血管平滑肌细胞或血管成纤细胞在内的血管细胞共培养[3]，那么，如果小血管移植物植入初期内皮细胞和平滑肌细胞的竞争性生长能够得到调控尤显重要。

降钙素基因相关肽(CGRP)是目前体内发现的最强的舒张血管活性肽，更重要的是具有保护内皮细胞活性的功能，能促进内皮细胞向受损血管壁迁移，刺激细胞增殖，同时抑制平滑肌细胞增殖和迁移[12-14]，因此，本文开展了CGRP修饰SF膜的研究，首先用己二酸对SF进行改性制备了带高负电荷的再生SF膜，进一步探索了CGRP通过静电相互作用在SF膜表面的加载能力，以期为SF小口径人工血管的设计提供新的思路。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：家蚕生丝，如皋春秋丝绸有限公司；己二酸(AA)，北京伊诺凯科技有限公司；透析袋(14 ku)，上海通善生物科技有限公司；溴化锂，合肥精汇化工研究所；1-乙基-3 (3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，Sigma上海贸易有限公司；吗啉乙磺酸(MES)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；降钙素基因相关肽，默克密理博公司；兔抗人降钙素基因相关肽一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔二抗，北京博奥森生物技术有限公司；BCA试剂盒、吐温-20和TMB显色液，上海碧云天生物技术有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，上海源叶生物科技有限公司；小牛血清，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；96孔细胞培养板，上海圣纳堡生物科技开发有限公司；Na2CO3，国药集团化学试剂有限公司。

仪器：PB-10型pH计，赛多利斯科学仪器有限公司；DF-101S型磁力搅拌器，上海予正仪器设备有限公司；DZF-6053型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Alpha 1-4 Lscplus型冷冻干燥机，德国Christ公司；Malvern ZS90型粒径电位分析仪，英国Malvern公司；Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪，美国Nicolet公司；X′Pert-Pro MPD型全自动X射线衍射仪，荷兰PANalytical B.V.公司；Bio-Tek型多功能全自动酶标仪，美国BioTek公司。

1.2 试样制备方法

1.2.1 SF溶液的制备

称取家蚕生丝以浴比为1∶50于煮沸的质量分数为0.06%的Na2CO3水溶液中搅拌均匀，30 min后取出用去离子水洗涤干净，重复3次。干燥后将脱胶的蚕丝纤维以浴比为3∶20溶解于9.3 mol/L溴化锂水溶液中，于(65±2) ℃搅拌直至完全溶解。将溶解液装入截留分子质量为14 ku的透析袋，于 4 ℃ 去离子水中透析3 d，得到再生SF水溶液，过滤后采用旋转蒸发法浓缩至质量浓度为40 mg/mL。

1.2.2 AA改性SF膜的制备

制备10 mg/mL的AA溶液，分别加入与AA量比为2.5∶1的EDC和NHS，搅拌均匀于4 ℃活化1 h。 向SF水溶液中添加质量分数为20%的MES混合均匀，然后按SF与AA质量比为100∶0、100∶0.5、100∶1、100∶1.5、100∶2和100∶2.5制备SF/AA混合溶液，冰浴搅拌反应30 min。然后将反应后的混合溶液装入透析袋中，于4 ℃冰箱内透析2 d。每个样品量取一定体积脱除细小气泡后，轻轻倒入聚苯乙烯板孔内，于40 ℃恒温干燥后取出，在室温下平衡12 h揭膜，得到AA交联改性SF膜。

1.3 测试与表征

1.3.1 热水溶失率测试

根据SF质量浓度和倒入板孔的体积，计算得到丝素膜中原有SF的质量m1。所有样品置于恒温恒湿环境平衡24 h后逐一称取质量，按浴比为1∶50浸渍于去离子水中，于37 ℃水浴振荡12 h，弃去样品，以3 000 r/min离心5 min收集上清液。采用BCA试剂盒并根据说明书标准步骤测定上清液中SF的质量浓度。

首先用BSA配制标准梯度质量浓度，用酶标仪检测562 nm处的吸光度(OD562)，绘制曲线拟合得到回归直线方程y=ax+b(R2≥0.99)(式中：x为BSA质量浓度，mg/mL；y为吸光度)。同时测定各样品的吸光度，根据y=ax+b计算各样品的SF质量浓度，进一步根据浸渍的体积计算各样品溶失的SF质量m2。根据下式计算热水溶失率：

S=m2/m1×100%

1.3.2 Zeta电位测试

将1.2.2节反应透析后的SF溶液稀释至质量浓度为1.0 mg/mL，采用粒径电位分析仪测定溶液中改性SF的Zeta 电位。

1.3.3 结构测试

将SF膜剪成细小粉末，收集透过孔径为50 μm网筛的粉末，采用傅里叶红外光谱仪测定样品的化学结构和分子构象。扫描次数为32，分辨率为2 cm-1，扫描范围为4 000～400 cm-1。

使用X射线衍射仪测定样品的结晶结构，采用CuKα射线，波长为0.154 06 nm，管电压为40 kV，管电流为35 mA，扫描速度为2(°)/min，记录2θ在5°～50°间的X射线衍射曲线。

1.3.4 SF膜表面CGRP加载能力测试

SF膜表面加载CGRP：将SF与AA 质量比为100∶0、100∶1和100∶2.5的改性SF膜按96孔细胞培养板的底面积剪成小圆片并铺于孔底部，每孔加入30 μL(180 ng)的CGRP水溶液，于4 ℃孵育12 h，然后室温风干，再用去离子水漂洗 2次，风干。

CGRP加载能力测定(酶联免疫吸附法)：每孔加入100 μL含5%小牛血清和0.05%吐温-20 的磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)，于37 ℃孵育1 h；漂洗后加入1∶1 000稀释的兔抗人降钙素基因相关肽一抗40 μL，于37 ℃孵育1 h；再次漂洗后加入1∶5 000稀释的HRP驴抗兔二抗40 μL，于37 ℃孵育1 h；漂洗后加入200 μL 的TMB溶液，于37 ℃孵育20 min；最后加入50 μL的2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。取上述反应液稀释相同倍数后，每个样品取200 μL溶液加入到新的96孔板内，用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度(OD450)值。

2 结果与讨论

2.1 AA改性SF的反应机制

有机合成和生物化学中，EDC和NHS是常用的水溶性催化交联剂，可催化介导羧基和氨基偶联成酰胺键[15]，反应机制如图1所示。EDC先活化AA端部的2个—COOH，使其充分地与SF分子上的—NH2反应形成酰胺键—CONH—，交联SF分子链或者接枝于SF分子链上。SF大分子之间也发生侧基—COOH 与—NH2的共价结合形成—CONH—。整个反应过程中，EDC和NHS只起到催化作用，形成中间体O—异酰基脲和NHS酯，再与—NH2共价结合后成为小分子副产物，未反应的EDC、NHS及生成的小分子副产物均可通过透析或者凝胶过滤除去。

图1 AA改性SF的反应机制Fig.1 Reaction mechanism of AA modified SF

2.2 AA改性SF的电负性分析

Zeta电位是带电分子或微粒表面剪切层的电位，水溶液环境下AA改性SF的Zeta电位测试结果如图2所示。可见，随着AA质量占比的增加，改性SF的电负性逐渐增加。研究初期，实验方案设计的SF与AA的最大质量比为100∶5，但研究发现当AA质量占比较大，即SF与AA质量比为100∶3时，SF膜的成型开始受到影响，因此，确定AA添加比例最大为100∶2.5。 AA改性SF后，当端部2个—COOH交联反应连接2个SF分子时，SF分子链上可接受质子的伯胺—NH2基团被反应形成酰胺键—CONH—，使SF分子中—COOH数量相对增多，净电荷负值增加；当AA的1个—COOH接枝反应在SF分子链上时，不仅与SF分子链上接受质子的伯胺—NH2基团反应，同时还引入1个—COOH，使净电荷负值增加。当SF与AA的质量比为100∶2.5时，SF溶液的Zeta电位由未改性SF溶液的-2.66 mV 下降为-5.4 mV，说明Zeta负电位值增加1倍。

图2 水溶液环境下AA改性SF的Zeta电位Fig.2 Zeta potential of AA modified SF in aqueous solution

2.3 改性SF膜的热水溶失率分析

对生物材料来说，水(组织液)环境不溶性是非常重要的，因为溶解产物易引起肌体炎症反应及免疫反应。图3示出37 ℃水环境下AA改性SF膜的热水溶失率。

图3 AA改性SF膜的热水溶失率Fig.3 Hot water loss rate of AA modified SF films. (a)BSA standard curve; (b)Loss rate of SF

由图3(a)BSA质量浓度-吸光度的标准曲线可得，其回归直线方程为y=0.545 9x+0.205 6，确定系数R2=0.996 5。由图3(b)可知，未改性SF膜中蛋白的溶失率小于10.5%，说明SF膜具有较好的热水稳定性；随着AA质量占比的增加，SF膜的热水溶失率进一步减小，当SF与AA的质量比由100∶0 增加为100∶1时，SF的热水溶失率下降显著；SF与AA的质量比为100∶1.5时，SF溶失率达到最小，随后趋于稳定。添加AA后，两端活化的—COOH 连接于SF大分子使SF材料形成了更稳定的网络结构，提高了SF的耐水性。

图4 AA改性SF膜的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of 4 000～2 000 cm-1 (a) and 2 000～1 000 cm-1 (b) of AA modified SF films

2.4 改性SF膜的化学结构与分子构象分析

2.5 改性SF膜的结晶结构分析

SF材料主要有2种结晶结构：Silk I和Silk Ⅱ。Silk Ⅰ(α螺旋和β转角)结晶衍射峰主要出现在12.2°、19.7°、24.7°附近，Silk II(β-折叠)结晶衍射峰主要出现在9.1°、20.7°、24.3°附近。图5示出AA改性SF膜的X射线衍射谱图。可知，AA改性前后SF膜均形成了稳定的结晶结构，AA改性后SF膜在12.2°附近的Silk Ⅰ特征衍射峰消失，19.8°附近的典型结晶峰变尖锐且峰尖偏移至20.6°附近，尤其是SF与AA的质量比为100∶1、100∶1.5和100∶2的3种SF膜，因为AA的交联使SF肽链之间形成了网络结构，促进了SF膜更稳定的结晶结构的形成，但AA添加过多，也会阻碍SF肽链间紧密有序的排列。另外，所有SF膜在24.3°附近出现Silk Ⅱ的结晶峰。

图5 AA改性SF膜的X射线衍射曲线Fig.5 X-ray diffraction curves of AA modified SF films

2.6 AA改性SF膜加载CGRP的能力分析

CGRP是1982 年采用分子生物技术和DNA基因重组技术研究发现的生物活性多肽，含有37个氨基酸残基，N末端和C末端均有激活受体并与受体高亲和性结合的活性位点[16-17]。已有研究证明，不恰当的共价结合反应封闭了生物活性分子的活性位点而使其丧失生物活性[18-20]，通过静电作用向生物材料中引入生物活性因子才可最有效地保护其活性。CGRP是等电点为9.5的表面带正电的活性物质，为保持CGRP活性，将AA引入SF分子链，使SF膜表面产生了更多的—COOH，溶液中—COOH失去质子(—COO-)从而提高了表面电负性，进一步通过静电相互作用在SF膜表面加载CGRP，加载示意图如图6所示。

图6 AA改性SF膜加载CGRP示意图Fig.6 Schematic diagram of CGRP loading on AA modified SF films

由图2可知，随着AA质量占比的增加，SF膜的负电荷也随之增加，当SF与AA的质量比从100∶0 变化为100∶1和100∶2.5时，SF的Zeta电位由-2.66 mV 下降为-3.95和-5.4 mV。图7示出AA改性SF膜上CGRP的加载能力。可知：随着SF膜表面负电荷的增加，因静电作用加载于膜表面的CGRP量逐渐增多，SF与AA质量比为100∶1的AA改性SF膜表面CGRP的加载量是未改性SF膜的1.22倍；当SF与AA质量比为100∶2.5时，改性膜表面CGRP的加载量有显著提高，达到未改性SF膜的9倍。

注：**表示p< 0.01。图7 AA改性SF膜上CGRP的加载能力Fig.7 Loading capacity of CGRP on AA modified SF films

3 结 论

降钙素基因相关肽(CGRP)是一种具有调控血管舒张和血管细胞竞争性生长的活性肽，分子表面带正电。为加载更多的CGRP，并保护CGRP分子中功能区域的侧基官能团的活性，选择带有2个—COOH 端的己二酸(AA)对丝素蛋白(SF)进行改性，使SF表面的负电荷得到显著的增加，大大提高了对CGRP的静电加载能力。当SF与AA的质量比从100∶0变化为100∶2.5 时，SF的Zeta负电位值增加1倍，SF膜表面CGRP的加载量增加9倍。 本文研究对SF用于小口径血管组织工程材料的开发与功能改性具有重要的参考作用。