基于GelMA 复合水凝胶的制备及性能研究1

强 娜，廖芳丽，解 芳，冯 颖，李佳佳，冯裕发

（惠州学院 化学与材料工程学院，广东 惠州 516007）

水凝胶是在组织工程和再生医学中应用的生物支架.水凝胶的高含水量，可调节的化学和物理性质，以及封装细胞、生物大分子（如肽/蛋白质、核苷酸和抗体）和治疗制剂的能力，开辟了各种潜在的应用［1-2］.特别是，允许原位交联的生物聚合物可用于开发可注射材料.由于天然或合成聚合物制成的可注射水凝胶已被广泛报道，并显示出其各自的优缺点［3-4］.例如，透明质酸、壳聚糖、藻酸盐、硫酸软骨素等天然水凝胶，因其良好的生物相容性和生物降解性而得到广泛应用，但由于其机械性能较低，且难以调节其降解速率和生物功能，其应用受到限制［5-7］. 另一方面，左旋聚乳酸（PLLA）、聚乙二醇（PEG）和聚乙烯醇（PVA）等合成聚合物水凝胶具有较高的机械强度和可调的微观结构，但经常缺乏一定的生物信号分子，因此，有必要开发集天然和合成聚合物的优点于一身的水凝胶［8-9］.

因此，为了同时获得具有良好生物相容性和机械性能的水凝胶，半天然和化学功能化水凝胶（如甲基丙烯酰化明胶（GelMA）出现了［10］.近年来，有报道此水凝胶与纤维支架联合应用于软骨［11］、心脏瓣膜［12］、肌腱［13］、肌肉［14］等软组织的再生.早在2000 年，Van Den Bulck等人开发了一种用甲基丙烯酸酐（MA）对明胶进行改性的方法，并获得了一种光交联明胶衍生物，称为甲基丙烯酰化明胶（GelMA）［15］.此后，GelMA作为一种具有吸引力的生物材料被广泛研究.多项研究表明，GelMA 水凝胶既适用于二维细胞播种，也适用于三维细胞封装，适用于不同的制造工艺，如微成型、自组装、微流体、生物打印、生物纺织品等.通过控制交联的程度，可以对明胶凝胶的机械强度进行有效调节.同时由于具有甲基丙烯酸酐基团，使得制备出来的水凝胶材料具有了光敏性.另外，在这个过程中，至多只有5%的明胶序列进行了反应，这样的结果是能够最大程度保留了明胶自身所携带的明胶功能氨基酸序列，例如RGD 多肽序列、MMP 降解序列，这些序列都可以与甲基丙烯酸不发生甲基丙烯酰化反应.所以，经过化学改性制备的GelMA 可以拥有良好的生物活性，可以促进细胞粘附，而且这种水凝胶材料经体内的蛋白酶就可以进行降解.

纯GelMA 水凝胶是一种良好的生物降解材料，然而，当它作为某些应用时，如作为引导骨再生材料使用时：凝胶时间长、机械强度低、降解时间短、溶胀率高，限制了其应用.此类水凝胶要成为合适的组织工程支架材料，必须具有较短的凝胶化时间以减少操作时间，合适的机械强度和降解时间以保持组织重建的空间，较低的溶胀率以降低创伤压力、避免炎症.

在所有合成的聚合物材料中，以聚乳酸（PLA）［16］、聚羟基乙酸（PGA）［17］及聚己内酯（PCL）［18］为代表的聚α－羟基酸和它们的聚合物是组织工程领域中研究最广泛的一类聚合物.此类高分子聚合物材料因生物相容性好、可降解且降解速度易于调控等优点，在生物材料领域占主导地位.

因此，本研究设计将PLLA 与GelMA 进行共混，通过热量分析（TG）、差示扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）、X 射线衍射（XRD）来测试复合水凝胶的热分解温度、玻璃化转变温度、结晶度等.根据分析结果探究不同比例的PLLA 与GelMA 共混的性能，并找出较适合的比例加强特定性能，为进一步将其应用于组织工程提供科学依据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

左旋丙交酯（L-LA）购于广东惠州华阳医疗器械公司；明胶，甲基丙烯酸酐，Lrgacure2959 购于Aladdin公司；本实验所用试剂均购于广东惠州南源化玻有限公司，所有试剂均为市售分析纯.

热重分析（TG）：热重分析采用TGA 209 F1热重分析仪，升温区间为35-600 ℃，升温速率为10K/min，吹扫气为氮气，流量为20mL/min，保护气为氮气，流量为20mL/min.

差示扫描量热分析（DSC）：TA instruments MDSC 2910，氮气气氛（40 mL/min），测定二次升温曲线.每个样品质量为3-5mg，升降温速率为10 ℃/min，样品扫描温度范围为0-250℃.

X－射线衍射分析（XRD）：日本RIGAKU 公司Ultima Ⅳ型X 射线衍射仪，广角测量，2θ 角为3°-60°，速度5°/min.

扫描电镜分析：室温下喷金.在5 kV 加速电压下FE-SEM（SU8010 field emission scanning electron microscope，Hitachi LTD，Tokyo，Japan）观察导管横断面形貌.

1.2 实验过程

1.2.1 聚左旋丙交酯（PLLA）的制备

采用封管本体聚合方式制备共聚物.安瓿瓶经洗液浸泡（加热至60-70 ℃）、洗净、烘干，干燥24 h 后备用.将一定量的经纯化后的L-LA 单体加入到干燥的30 mL 聚合管中，用氩气置换3 次，加入异丙醇为引发剂并控制聚合物的分子量（［M］/［I］=600/1），再加入辛酸亚锡的甲苯溶液（［M］/［Cat］=1 000/1），混合均匀，在室温下抽真空2 h 以除去残留的溶剂，封管，置于130 ℃的油浴中反应20 h.反应结束后聚合管冷却至室温，沿瓶颈切断后，加入5 mL 氯仿将反应物完全溶解后，用8-10倍氯仿量的冷甲醇沉淀，重复溶解-沉淀两次，真空干燥24 h得产物.

1.2.2 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的制备

称取定量的明胶，加入到锥形瓶中并加入配置好的适量PBS 溶液.水浴加热到60 ℃，不停搅拌至明胶全部溶解.待明胶完全溶解后，继续加热并逐滴滴加甲基丙烯酸酐进入锥形瓶，持续滴加一个小时.滴加结束两小时后，将预热到50 ℃的定量PBS溶液加入到锥形瓶，再持续搅拌15 分钟.搅拌完毕后将锥形瓶中的溶液倒入透析袋中，透析一周.透析结束后，将收集的液体加热到60 ℃，用孔径为0.22微米的微孔滤膜趁热过滤，然后将所得液体搁置到冰箱预冻过夜，然后放置到冷冻干燥机上进行冷冻干燥得到GelMA白色絮状材料.

1.2.3 PLLA与Gel-MA复合物的制备

分别称量左旋聚乳酸（PLLA）与GelMA 比例为1∶4、1∶1、4∶1 的原料，编号为1、2、3.配置0.25%g/ml 的Lrgacure2959 光引发剂溶液.用玻璃培养皿装取适量光引发剂溶液溶解GelMA，完全溶解后再加入PLLA，并用分散机将粉末打匀，直至PLLA 悬浮在溶液中，整个过程需要避光进行.将制备好的溶液放10mW/cm2紫外灯下进行反应10 分钟，制成PLLA/GelMA 交联的水凝胶.

2 结果与讨论

2.1 PLLA性能的测定

图1 PLLA的TG曲线

由图1可知，图像中只有一个阶梯，表示着只有一个分解过程，PLLA 完全分解.图2 可知，升温过程中，图像先有一个冷结晶峰，再有一个向上的尖锐峰（熔融峰），说明PLLA为半结晶状态.由图1和图2可分析得出PLLA的热分解温度为299℃，熔点为166.6 ℃，玻璃化转变温度为52 ℃.与所查的文献资料非常接近，说明合成的聚合物的热稳定性较好，有且只有一个分解过程，符合均聚物的特点，说明反应物没有太多副反应发生.

图2 PLLA的DSC曲线

图3是PLLA 的XRD 衍射图像，PLLA 的衍射峰位置在22.19°，结晶度在50%，峰面积占了整个图像面积的一半左右，图像有尖锐峰，且峰被隆拱起，说明PLLA为试样中晶态与非晶态“两相”共存，PLLA为半结晶物质.

图3 PLLA的XRD谱图

2.2 GelMA性能的测定

根据图4 显示可知，TG 图像中曲线有两个分解过程，第一个分解过程先损失12%，第二个分解过程失重69.3%，还有18.7%未损失.GelMA 是甲基丙烯酸酐修饰过的明胶，其中明胶的熔点在350 ℃左右，甲基丙烯酸酐的沸点在87 ℃，可以看出前一段为甲基丙烯酸酐，后一段为明胶或GelMA，剩余的物质是明胶在高温下形成的透明坚硬非晶物质.根据图4 分析测得较大的热分解温度为281.9 ℃，TG图中有两个分解过程，符合明胶被甲基丙烯酸酐修饰的特点.

图4 GelMA的TG曲线

2.3 PLLA与GelMA复合水凝胶性能的测定

由前面的分析可知，纯的PLLA是均聚物，PLLA与GelMA 的混合物中有一个分解过程，呈现出类似无规共聚物的特点.从图5 中可以看出，PLLA 与GelMA 的比例1∶4、1∶1、4∶1的共聚物分解温度分别为235.9 ℃、259.8℃、244.8 ℃，根据所得分解温度可知当PLLA 与GelMA 的比例为1∶1 时分解温度最高.由此可知添加GelMA 对PLLA 的热稳定性有影响，PLLA 与GelMA 的比例为1∶1热稳定性最佳.

图5 PLLA、GelMA及复合水凝胶的TG曲线

图6可知PLLA 与GelMA 的比例1∶4、1∶1、4∶1 的共聚物熔点分别为127.5 ℃、127.5 ℃、117.5 ℃，PLLA与GelMA 的比例1∶4、1∶1 比例的熔融温度相近，看不出较大的差别，但4∶1 时温度会较低一点. PLLA 与GelMA的比例1∶4、1∶1、4∶1的各种比例共聚物升温过程中，不同比例的PLLA 与GelMA 共聚物，在升温过程中，其DSC曲线先呈现一个下降峰，再有一个向上的尖锐峰（熔融峰）. 说明各比例混合物为半结晶物质.PLLA 与GelMA 的比例1∶4、1∶1、4∶1 的共聚物的玻璃化转变温度分别为25℃、25℃、20℃.常温下各混合物都可以达到玻璃化转变温度，其中聚PLLA与GelMA 4∶1比例的玻璃化转变温度会更低一点.

图6 复合水凝胶的DSC曲线

根据XRD 测试的可知，由图7 和图8 测试结果显示，两个图均有隆峰，且都有尖锐峰，这表现出部分晶态，也就是说有部分为非晶态.根据各衍射峰的面积之和Sc、弥散隆峰面积Sa 和结晶度＜Xc＞，得出大致的结晶度＜Xc＞=Sc/（Sc+Sa）. 图7 在17.43°和23.82°有两个衍射峰，通过计算可得结晶度在18.7%；图8 的衍射峰位于19.07°，通过计算可得结晶度在15%；它们的衍射峰又细又长，所占的面积很小.根据衍射峰的面积与整个峰面积之比可知，共混之后的结晶度不高，同样为部分结晶物质.

图7 PLLA与GelMA1：1复合水凝胶的XRD谱图

图8 PLLA与GelMA4：1复合水凝胶的XRD谱图

由SEM 图像观察到三个比例共混后的材料，其中图9 为PLLA 与GelMA 1∶4 共 混 物SEM 图，图11 为PLLA与GelMA 4∶1共混物要SEM图，二者均呈现团聚集块状，物质凝聚成一团，呈现出无规排列的状态，图10为PLLA与GelMA1∶1共混物SEM图，呈现条块团聚状，条块明显，呈现出层叠状，结构变得更规整.由此可见，当PLLA 与GelMA 共混比例为1∶1 时，物质结构更规整.

图9 PLLA与GelMA 1∶4复合凝胶的SEM图像

图10 PLLA与Gel-MA 1∶1复合凝胶的SEM图像

图11 PLLA与GelMA 4∶1复合凝胶的SEM图像

3 结论

PLLA 具有众多优良的性质，它在亲水性、生物相容性等还不能完全满足细胞组织工程和一些生物医用工程的实际运用.GelMA 是当今常用的3D 打印材料，但是其力学性能的不足也限制着它的发展.为了实现PLLA与GelMA更好的应用，通过共混方法对二者进行改性.结果表明PLLA 与GelMA 的共混物热力学性能较为稳定，在常温下基本没什么变化，PLLA 结晶度下降，使得材料的耐冲击性增强，韧性变好，延展性变好.观察其中PLLA与GelMA含量为1∶1时为最佳比例.通过PLLA 与GelMA 共混物的基本性质可知此材料可用于生物医用材料中.随着研究的继续，将探究PLLA与GelMA共混物在医用方面和3D打印材料的价值.这将是一样非常有前景的研究方向，而且能带给人们更多的便利.