五倍子与抗菌药联合用药对产ESBLs大肠埃希菌的作用研究

王 婧，雷春娟， 濮鑫怡， 徐 泽， 陈海峰

(1. 江苏农牧科技职业学院， 江苏泰州225300 ； 2. 中国动物疫病预防控制中心， 北京朝阳100126)

大肠埃希菌作为人和动物肠道内的正常菌群，在特定条件下，该菌的某些血清型可导致人和动物发病[1]，表现为败血病、卵黄性腹膜炎和慢性呼吸道病等[2]。在兽医临床，主要引起如仔猪黄白痢、猪水肿病、禽大肠杆菌病等常见病、多发病[3]，每年我国由大肠埃希菌造成的畜禽养殖业经济损失可达数10亿元。近年来细菌的耐药性问题日趋严重，肠杆菌科细菌中产超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)比例不断增加，使得革兰阴性菌耐药率逐年上升，呈世界性流行趋势。寻找新型抗菌药物成为人们关注和研究的焦点。五倍子为漆树科植物盐肤木、青麸杨或红敷杨叶上的虫瘿，现代医学研究证明，五倍子的药理活性主要包括杀精、抗细菌、抗氧化活性[4-5]和抗龋齿作用[6]，有研究表明，五倍子提取物对唾液中的浮游细菌、水产生物常见致病菌等均具有明显的抑菌活性[7-8]。为进一步探究五倍子水提物与抗菌药联合使用对产ESBLs大肠埃希菌的抑制作用，本试验对临床分离菌株的ESBLs基因型进行了鉴定，并采用微量棋盘稀释法测定五倍子水提物与抗菌药联用后的部分抑菌浓度指数，判定抗菌效果是否发生明显改变，对临床上防治此类细菌感染具有重要意义，为五倍子在临床的开发应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本试验所使用菌株分离于腹泻仔猪的肛拭子样本，由本实验室分离、鉴定保存。氨曲南(30 μg/片)、头孢他啶(30 μg/片)、头孢曲松(30 μg/片)、头孢噻肟(30 μg/片)、头孢他啶/棒酸(30 μg/片)、头孢噻肟/棒酸(30 μg/片)、庆大霉素(30 μg/片)，均购自杭州滨河微生物试剂有限公司；MH、LB等培养基，均购自杭州百思生物技术有限公司；PCR相关试剂，均购自TaKaRa公司；硫酸庆大霉素、阿莫西林、环丙沙星、氟苯尼考，均购自阿拉丁生化科技股份有限公司；头孢噻呋钠、盐酸左氧氟沙星，均购自江苏南通飞宇生物科技有限公司，且纯度均高于98.5%。

1.2 产ESBLs菌株的检测与验证 按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的ESBLs标准纸片扩散法进行操作。对实验室保存的81株大肠埃希菌活化后进行氨曲南、头孢他啶等的药敏试验，试验结束后测定抑菌圈并进行记录。若抑菌圈满足下列任一条件即为疑似产ESBLs菌株：氨曲南(30 μg/片) ≤27 mm、头孢他啶(30 μg /片) ≤22 mm、头孢曲松(30 μg /片) ≤25 mm、头孢噻肟(30 μg /片) ≤27 mm。

进一步采用以下药敏纸片进行产ESBLs确证，若采用头孢他啶(30 μg /片)、头孢他啶/棒酸(30/10 μg /片)、头孢噻肟(30 μg /片)、头孢噻肟/棒酸(30/10 μg /片)复合药敏纸片进行试验，当任何一种复合剂纸片抑菌圈直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌圈直径5 mm，可认为其携带产ESBLs耐药基因。

1.3 产ESBLs基因型的检测

1.3.1 引物合成 引物参照GenBank登录的大肠杆菌基因序列，根据参考文献[9-11]分别设计了SHV、OXA、CTX-M-25引物，见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 产ESBLs基因引物序列Table 1 The primer sequences of ESBLs-producing genes

1.3.2 PCR扩增 采用煮沸法制备菌株DNA模板，配置25 μL PCR扩增体系：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaq酶 12.5 μL，去离子水9.5 μL。PCR扩增参数如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s， 60 ℃(SHV)45 s，55 ℃(OXA)45 s，56 ℃(CTX-M-25)45 s；72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增条带大小与目的条带一致的PCR产物送生物公司进行序列测定，并利用BLAST进行基因对比分析。

1.4 药物的制备与稀释 将五倍子药材敲碎，除去虫瘿，粉碎后过60目筛，称取100 g五倍子粉末，加入10倍量的80%丙酮，充分搅拌后置于45 ℃水浴锅中保温浸提3 h，过滤保存滤液，同样方法再次提取，合并2次滤液后采用旋转蒸发浓缩至适当体积后，冷冻干燥成粉末即得，共获得74.2 g，产率为74.2%。临用前称取适当五倍子提取物，加入水将其溶解至4 096 μg/mL备用。

1.5 五倍子提取物及抗生素的单药最低抑菌浓度(MIC)测定 最低抑菌浓度采用微量稀释法测定五倍子对产ESBLs菌的MIC，具体操作如下：扩增好的菌液用MH肉汤调整至含菌量约为1×106CFU/mL备用。在96孔板每孔加入100 μL MH肉汤培养基，在A1孔加入100 μL 药液使终浓度为1 024 μg/mL，对A1～A10孔进行倍比稀释，弃掉第A10孔多余的液体，然后每孔加入菌液100 μL，重复3次。每行第11、12孔以不加药物或不加菌液分别作为阳性和阴性对照，于37 ℃培养14～18 h后观察结果，以不生长细菌孔最低药物浓度为MIC浓度。

1.6 与西药的棋盘试验 采用微量方阵棋盘法测定五倍子提取物及各抗菌药联合使用的抗菌效果。将药物用MH培养基在灭菌离心管中倍比稀释为32～4 096 μg/mL，取五倍子药液50 μL由高浓度至低浓度加入96孔板的第1～8列，取另一种抗生素50 μL由高到低依次加入96孔板的A～H行，每孔再加入100 μL调整好浓度的菌液，第9、10列分别作为阴性和阳性对照，微量振荡器震荡使药液混匀，37 ℃下培养14～18 h，观察五倍子提取物与抗菌药联用对产ESBLs菌的抑制作用，试验重复3次。

根据抑菌结果计算联合抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration index，FICI)。FICI=(MIC五倍子联合/MIC五倍子)+(MIC抗菌药联合/MIC抗菌药)，结果的判断依据是：FICI≤0.5为协同作用，FICI>4为拮抗作用，0.5

2 结果

2.1 产ESBLs大肠埃希菌的筛选 按照CLSI的标准，对本实验室保存的81株临床分离的大肠埃希菌进行产ESBLs筛选，对菌株进行初筛之后参照1.2的方法进行确证，最终81株大肠埃希菌中鉴定得到26株产ESBLs大肠埃希菌，检出率为32.1%。

2.2 产ESBLs大肠埃希菌基因型的确定 对上述鉴定为产ESBLs的大肠埃希菌进行基因型的确定。PCR结果显示，26株产ESBLs菌中SHV阳性4株，OXA阳性9株，CTX-M-25阳性10株，其中有2株菌对这3种基因型检测结果均为阳性，电泳结果见图1。

2.3 五倍子提取物与抗菌药单独作用于产ESBLs菌的MIC 根据上述产ESBLs鉴定以及基因型鉴定结果，后续MIC试验针对3个ESBLs基因阳性的2株菌进行，分别是TZ3-1、TZ8-2。五倍子提取物与抗菌药单独作用于2株产ESBLs菌的MIC值分别见表2和表3。从表中可看出，硫酸庆大霉素和头孢噻呋钠对TZ3-1、TZ8-2两株菌的MIC值均高于1 024 μg/mL， 盐酸左氧氟沙星对这2株菌的抑菌效果最佳，MIC分别为16 μg/mL和32 μg/mL。五倍子提取物对这2株菌MIC值分别达到32 μg/mL和64 μg/mL，表明其对产ESBLs大肠埃希菌具有较好的抑制作用。

图1 3种基因型阳性的电泳图Fig.1 Electrophoretogram of three positive genotypesM:Marker;1:OXA;2:CTX-M-25;3:SHV

2.4 五倍子联合抗生素的抗菌作用 五倍子联合抗生素对产ESBLs菌TZ3-1株的抗菌作用见表2，对TZ8-2的联合抑菌作用见表3。从表中可看出，五倍子与硫酸庆大霉素和环丙沙星联用对2株产ESBLs菌均呈协同作用；与头孢噻呋钠联用仅对TZ3-1表现为协同作用，但对TZ8-2的FICI值仍然较低，可能也表现为协同作用；五倍子与阿莫西林、盐酸左氧氟沙星、氟苯尼考联用表现为无关作用。

表2 五倍子联合抗生素对TZ3-1的抗菌作用结果Table 2 The antibacterial effect of Galla chinensis combined with antibiotics on TZ3-1 isolate

表3 五倍子联合抗生素对TZ8-2的抗菌作用结果Table 3 The antibacterial effect of Galla chinensis combined with antibiotics on TZ8-2 isolate

3 讨论

β-内酰胺酶有多种分类，与临床关系密切的有超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，头孢菌素酶(Amp cephalosporinase，Amp C)和碳青霉烯酶等。这些酶的基因既可以存在于细菌的染色体内，也可以存在于质粒当中，并且可协同氨基糖苷类、磺胺类和氟喹诺酮类耐药基因随质粒共同转移，在临床分离株中广泛传播。到目前为止，全世界一共发现了超过200种ESBLs，根据其编码基因的同源性，可将ESBLs分为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型[13]，近年来CTX-M型已发展成为全球人医和兽医临床最流行的ESBLs型。在国内近10年期间报道的鸡源、食品源或其他动物源性ESBLs大肠埃希菌中CTX-M型的检出率更是高达80%以上。德国、罗马尼亚等也均报道鸡源肠杆菌中ESBLs检出率高达60%～81%[14]。本试验中产ESBLs菌检出率为32.1%，且主要以CTX-M基因型为主，产ESBLs检出率比刘雅妮等[15]2011年报道的从上海地区分离的猪源大肠埃希菌产ESBLs检出率有所上升，而与近两年报道的河南[16]、贵州[17]等地的猪源大肠埃希菌ESBLs相比检出率低。

天然产物资源丰富，含有多种活性成分，在抗感染方面发挥独特的作用。许多研究表明，五倍子具有良好的抗菌作用[18-19]，五倍子与抗生素联合抑制作用鲜有报道，为了更加全面的了解五倍子的药理作用，本试验通过微量棋盘试验研究了五倍子与常用兽用抗生素的联合抑菌作用进行了测定。结果显示，五倍子与硫酸庆大霉素和头孢噻呋钠联用对产ESBLs菌具有协同抑制作用，与环丙沙星联用时表现为协同或相加作用。本试验结果虽然五倍子和阿莫西林、盐酸左氧氟沙星和氟苯尼考联合使用时表现为无关作用，但是从联合使用后的MIC值可以看出较单独使用有明显的降低。由此可见，若五倍子与抗菌药联用可大大减少抗菌药物临床使用量，表明五倍子具有较好的开发应用价值。