鲜、干延胡索药材中生物碱和核苷类成分的含量差异

杨 勤，谷文超，祁俊生，沈 力，周 浓*

(1. 重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；2. 重庆三峡学院 生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404000；3. 大理大学药学院，大理 671000)

延胡索又称元胡，为罂粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang)的干燥块茎，性辛、苦、温，具有活血行气止痛等功效，为我国传统道地药材“浙八味”之一[1-2]。延胡索适应性强、产地广泛，自然分布在江苏、安徽、浙江、湖北等地区，后被陕西、四川、重庆等地区引种栽培[3-4]。延胡索含有丰富的化学成分，如生物碱、多糖、核苷、酚酸、蒽醌类化合物等[5-7]。其中生物碱作为其主要的化学成分，具有镇痛、抗心律失常，抗肿瘤等多种临床活性[8-10]。刘珍珍等[11]通过研究水煮、水蒸、醋煮、盐煮4种加工方法对延胡索中5种生物碱含量的影响，发现这4种加工方法得到的5种生物碱总量由高到低依次为水蒸>水煮>醋煮>盐煮。余平等[12]对延胡索不同部位生物碱含量进行了比较，发现延胡索表皮生物碱含量最高，去皮延胡索生物碱含量最低。张静等[13]通过研究不同产地延胡索中的6种生物碱含量差异，发现生物碱的含量受产地因素影响较大，其品质表现出一定的地域环境依赖性，并且商品等级对生物碱的含量无显著影响。核苷类成分具有降压、保肝、调节免疫功能、抗心律失常等多种生物活性[14]，延胡索中的核苷类成分与其生物活性具有一定关联性，因此也可作为延胡索质量评价指标之一[15]。

鲜药一般是指未经任何可能导致药材成分改变或损失的处理的“原生药材”，即在药材采收后使用的中药原料[16]，是中医药和民族药特色之一，具有气味正、质量好等特点。干药是鲜药经一定的加工处理后，水分及挥发性成分流失后的药材，其特点是能长期保存，便于运输。研究表明，鲜药与干药有效成分及药理药效具有一定差异[17]。陈莉萍等[18]比较了鲜、干马齿苋药材品质及抗菌作用的差异性，发现鲜马齿苋中的总黄酮质量浓度高于干马齿苋，且鲜马齿苋的抗菌作用明显优于干马齿苋。朱南南等[19]对鲜、干金钗石斛的化学成分及抗氧化活性进行了比较研究，发现金钗石斛鲜品的总生物碱和多糖含量及其对羟自由基的清除率和抗氧化能力均显著高于干品。目前，对于延胡索鲜、干药材的有效成分差异性研究未见报道。本研究采用HPLC法，对8个产地鲜、干延胡索药材中的6种生物碱和3种核苷进行对比分析，明确鲜延胡索与干延胡索品质的差异，为延胡索干、鲜品的临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪(LC-20A型号，日本岛津公司；1260型号，美国安捷伦公司)；万分之一分析天平(CP225D型号，德国Sartorius公司)；超声波清洗机(SB-5200DTN型号，宁波新芝生物科技股份有限公司)；多管架自动平衡离心机(TDZ5-WS型号，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 试验材料

1.2.1 药材来源与处理

延胡索新鲜块茎采集于重庆、浙江、江苏、陕西和安徽5个省市8个不同产地种植大户，每份样品均取自50株成熟植株块茎以保证样品代表性，由重庆三峡学院周浓教授鉴定为罂粟科植物延胡索(C.yanhusuoW. T. Wang)块茎，样品信息见表1。

新采集的延胡索药材经洗净，去杂，晾干水分后，切碎混匀并采用四分法进行分样，取对角线的2份样品匀浆处理后得延胡索鲜药材，剩余样品于45℃干燥箱中烘至恒重，粉碎过50目筛得延胡索的干药材。鲜药材中有效成分含量为折干率折算后的数据，各产地延胡索折干率见表1。

表1 样品来源

1.2.2 试验试剂

原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号分别为：110853-201003、110732-201309、110713-201212、110726-210213、120928-201208)；盐酸黄连碱、脱氢紫堇碱对照品(成都曼思特生物科技有限公司，纯度经HPLC峰面积归一化法计算大于98%)；尿苷、腺苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110887-200202，110879-200202)；鸟苷对照品(南京都莱生物技术有限公司，纯度经HPLC峰面积归一化法计算大于98%，批号961-07-9)；色谱用乙腈、甲醇(色谱纯，德国默克公司)；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 生物碱类的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

分别精密称取减压干燥至恒重的原阿片碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱和延胡索乙素对照品适量，加甲醇溶解制成浓度分别为0.538、0.518、0.435、0.560、0.500、0.590 mg/mL混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取“1.2.1”延胡索新鲜和干燥药材各1.0 g，精密称定，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液20 mL，浸泡1 h，超声提取40 min，放冷，过滤，滤液加70%甲醇定容至25 mL，摇匀，即得。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：Durashell C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A(乙腈)-B(0.2%冰醋酸溶液，三乙胺调节pH=5.05)，梯度洗脱：0～15 min，20% A；15～35 min，20%～80% A；检测波长：280 nm；体积流量：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35℃[13]。按照上述色谱条件进行分析，各成分分离度良好，对照品和样品HPLC色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)及S16样品(B)的HPLC图谱Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed standard sample solution(A) and sample(B)

2.1.4 结果与分析

由表2可以看出，8个不同产地鲜、干延胡索中的生物碱含量具有显著性差异(P<0.05)，其中原阿片碱含量在0.126 8～0.351 3 mg/g之间，盐酸黄连碱含量在0.342 8～1.149 0 mg/g之间，盐酸巴马定含量在0.028 4～0.320 7 mg/g之间，盐酸小檗碱含量在0.023 5～0.109 3 mg/g之间，脱氢紫堇碱含量在0.075 8～1.228 4 mg/g之间，延胡索乙素含量在0.265 9～0.655 8 mg/g之间。8个产地中，S16(重庆市开县大德镇九岭村延胡索干品)生物碱总量最高，含量为3.124 9 mg/g。根据含量比可以看出，6种生物碱含量大小总体表现为盐酸黄连碱>延胡索乙素>原阿片碱>脱氢紫堇碱>盐酸巴马汀>盐酸小檗碱，其中干品延胡索中的原阿片碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱含量均大于鲜品，而鲜品延胡索中的延胡索乙素大于干品，原因可能是烘干过程中延胡索乙素部分被分解。

表2 不同产地延胡索鲜品和干品中生物碱的含量

续表2 不同产地延胡索鲜品和干品中生物碱的含量

2.2 核苷类的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取减压干燥至恒重的尿苷、鸟苷、腺苷对照品适量，加纯净水溶解并制成质量浓度分别为1.212、0.804、1.200 mg/mL的对照品贮备液。取各对照品贮备液适量，加纯净水定容至10 mL制成混合对照品溶液，各核苷类质量浓度分别为242.40、160.80、120.00 μg/mL。并逐级稀释，得到一系列不同质量浓度的3种核苷混合对照品溶液，置于4℃的冰箱内，临用前以0.22 μm微孔滤膜滤过。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取“1.2.1”延胡索新鲜和干燥药材各1.0 g，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加水10 mL，称定重量，混匀，密封，室温下超声30 min(300 W，40 kHz)，取出，放至室温，用水补足减失重量，倒入离心管中，4 000 r/min离心10 min，取上清液以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得

2.2.3 色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A(甲醇)-B(水)，梯度洗脱：0～10 min，1%～5% A；10～15 min，5%～15% A；15～22 min，15%～17% A；22～26 min，17%～20% A；26～32 min，20%～24% A。检测波长：260 nm；体积流量：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35℃[15]。按照上述色谱条件进行分析，各成分分离度良好，对照品和药材色谱图见图2。

图2 混合对照品(A)及S14样品(B)的HPLC图谱Fig. 2 Mixed reference(A) and S14 sample's of C. yanhusuo(B) HPLC

2.2.4 结果与分析

由表3可以看出，8个不同产地鲜、干延胡索中的核苷含量具有显著性差异(P<0.05)，尿苷含量在0.021 4～0.178 2 mg/g之间，鸟甘含量在0.020 0～0.194 4 mg/g之间，腺苷含量在0.033 5～0.165 4 mg/g之间。8个产地中S14(安徽省芜湖县花桥镇苗育村延胡索干品)核苷总量最高，为0.572 8 mg/g，并且8个产地延胡索干品中的3种核苷含量均大于鲜品。延胡索鲜品中3种核苷含量大小依次为腺苷>尿苷>鸟苷，而干品中大小依次为尿苷>鸟苷>腺苷，表明在烘干过程中核苷含量变化明显，结合表3数据可以看出，尿苷和鸟苷变化较大，腺苷含量变化较小。

表3 不同产地延胡索鲜品和干品中核苷的含量

2.3 相关性分析

运用SPSS 20.0软件对不同产地鲜、干延胡索中的6种生物碱和3种核苷进行相关性分析，结果见表4。从表4可以看出生物碱与核苷之间存在一定的相关性，其中盐酸巴马汀与尿苷、鸟苷呈极显著正相关(r=0.664，0.704，P<0.01)，与腺苷呈显著正相关(r=0.585，P<0.05)；盐酸小檗碱与鸟苷呈极显著正相关(r=0.627，P<0.01)，与尿苷、腺苷呈显著正相关(r=0.592，r=0.503，P<0.05)；脱氢紫堇碱与尿苷、鸟苷呈极显著正相关(r=0.720，0.769，P<0.01)，与腺苷呈显著正相关(r=0.583，P<0.05)；延胡索乙素与尿苷、鸟苷、腺苷呈极显著负相关(r=-0.608，-0.625，-0.588，P<0.01)。各生物碱之间也存在一定相关性，原阿片碱与延胡索乙素呈极显著正相关(r=0.624，P<0.01)；盐酸巴马汀与盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱呈极显著正相关(r=0.935，0.925，P<0.01)；盐酸小檗碱与脱氢紫堇碱呈极显著正相关(r=0.885，P<0.01)。同时，各核苷之间也具有一定相关性，尿苷与鸟苷、腺苷呈极显著正相关(r=0.990，0.948，P<0.01)，鸟苷与腺苷呈极显著正相关(r=0.926，P<0.01)。

表4 不同产地延胡索鲜品和干品各成分间相关性矩阵

2.4 聚类分析

运用SPSS 20.0软件对不同产地鲜、干延胡索中的生物碱含量和核苷含量作为指标分别进行聚类分析，采用系统聚类中的Ward法，选取平方Euclidean距离作为样品度量的标准，绘出树状图，结果详见图3、4。从图3可以看出，以6种生物碱为指标，当Euclidean距离为20时，可将16个样品分为两类：第I类包括S2、S5、S6、S8、S11、S12、S14、S16，此类样品多为干品，生物碱总量较多。第II类包括S1、S3、S4、S7、S9、S10、S13、S15，此类样品多为延胡索鲜品，生物碱总量相对较少。从图4可以看出，当Euclidean距离为20时，也将16个样品分为两类：第I类包括S2、S12、S14、S16，这类样品均为延胡索干品，核苷总量丰富。第II类包括S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S13、S15，这类样品包含延胡索干品和鲜品。总的来看，不同产地延胡索分类交叉严重，有效成分含量差异性较大，干品延胡索有效成分含量显著。

图3 生物碱聚类图Fig. 3 Alkaloid cluster

图4 核苷聚类图Fig. 4 Nucleoside cluster

3 讨 论

研究表明，新鲜药材在干制过程中，化学成分的种类和含量会发生明显变化。除水分的流失外，许多药材在干制过程中其易挥发性成分和易氧化或易分解的成分均有程度不同的损失[20]。本研究结果表明，干品延胡索中5种生物碱含量(原阿片碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱)和3种核苷含量(尿苷、鸟苷、腺苷)均大于鲜品，表明延胡索在烘干过程中，鲜品中的水分被蒸干，而以上8种有效成分损失较小，在药材质量相同的情况下，干品延胡索中的生物碱和核苷含量均大于鲜品。而对于延胡索乙素，其作为延胡索中最重要的生物碱之一，在2020版《中国药典》中是延胡索“含量测定”项下的指标性成分[1]。研究表明，延胡索乙素是延胡索的主要活性成分，具有镇痛、催眠、降低冠脉阻力及增加血流量等作用[21]。本研究中，鲜品延胡索的延胡索乙素含量大于干品，原因是延胡索乙素不稳定，受光热作用易分解[22]，在干制过程中延胡索乙素分解严重，因而鲜品延胡索中延胡索乙素含量较高。8个产地延胡索干品中，S6(江苏省通州区张芝镇启桥村)、S12(浙江省磐安县尚湖镇小坑门)延胡索乙素含量符合2020年版《中国药典》一部中延胡索(元胡)药材项下“含量测定”的限定标准(按干燥品计算，延胡索乙素不得少于0.05%)[1]，其余产地延胡索干品均不符合。

本研究结果表明，8个产地的延胡索生物碱和核苷含量均具有显著性差异(P<0.05)，表明产地不同，延胡索有效成分含量差异性较大，与安艳等[23]对不同产地延胡索产量品质研究结果一致。相关性分析结果表明，延胡索中各有效成分之间具有不同程度的相关性。6种生物碱中，除盐酸黄连碱与其他有效成分无显著相关性，其余成分之间均具有显著相关性。聚类分析结果表明，干品延胡索分在第I类，鲜品延胡索多分在第II类，结合有效成分含量，干、鲜品差异性较大，干品延胡索中有效成分总量较高。

本研究对8个不同产地鲜、干延胡索药材中的6种生物碱和3种核苷进行对比分析，比较了鲜品延胡索与干品延胡索品质的差异，为延胡索药材的系统开发利用提供了理论依据。