响应面法优化黑牛肝菌多酚提取工艺及其抗氧化活性研究

胡栋宝，郑付聪，杨 猛，张济祥

(玉溪师范学院 化学生物与环境学院, 云南 玉溪 653100)

植物多酚是多羟基化合物总称，具有抗氧化性、抗衰老、抗肿瘤等多种生物活性[1]，近年来多酚类物质的活性研究已越来越多地引起学者们的广泛关注[2]。 黑牛肝菌(Boletusaereus)是一种可食用菌，口感香脆，味道鲜美，药用价值颇高，含有多糖、多酚等多种活性成分，其多糖对小鼠酒精性肝损伤具有明显保护作用[3-4]，其提取物对大鼠具有明显的降血脂及抗氧化作用[5]。响应面分析法是采用多元二次回归方程作为函数来优化提取工艺过程的一种高效实用的方法，可信度高，被广泛应用于各种化工过程的提取工艺优化研究中。目前有关黑牛肝菌多糖的药理活性报道较多[3-5]，但关于其响应面法多酚提取及抗氧化活性的研究尚未见文献报道。为了充分利用该食用菌资源，本研究利用超声波辅助提取响应面优化法获取黑牛肝菌多酚提取的最佳工艺条件，并利用DPPH自由基清除等试验研究黑牛肝菌多酚提取物的抗氧化活性，为该食用菌功效成分的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑牛肝菌(云南省玉溪市新平县)；福林酚试剂(分析纯,上海金穗生物科技有限公司)；没食子酸标准品(分析纯，武汉远成共创科技有限公司)； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析纯，Sigma公司)；抗坏血酸(分析纯，天津市双船化学试剂厂)；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(分析纯，成都艾科达化学试剂有限公司)；磷酸氢二钠、过硫酸钾(分析纯，天津市凤船化学试剂科技有限公司)；三氯乙酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；无水碳酸钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯化铁、无水乙醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)。

1.2 主要仪器

分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；超声清洗仪(上海声源超声波仪器设备有限公司)；UV-2700紫外分光光度计(日本岛津公司)； SHZ -DS-III型循环水真空泵(河南巩义市予华仪器有限责任公司)；RE2000A 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 标准液的配制

取0.005 g没食子酸标准品蒸馏水溶解，置于50 mL容量瓶,定容至刻度线, 即得浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。

1.3.2 标准曲线的建立

准确量取上述标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL比色管中，依次加入30 mL蒸馏水、2.5 mL福林酚试剂、7.5 mL质量百分数10%的碳酸钠溶液，于61℃水浴反应10 min，全波长扫描，于770 nm测定吸光值，以标准液为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线[6]，标准曲线为Y=149.93x+0.0182,R2=0.9985。

1.3.3 样品中多酚的测定

准确吸取样品溶液0.5 mL于50 mL比色管，分别加入30 mL蒸馏水、 2.5 mL福林酚试剂、7.5 mL质量百分数10%的碳酸钠溶液,于61℃水浴反应10 min，冷却后在770 nm处测定其吸光度。

1.4 单因素试验

1.4.1 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

将黑牛肝菌子实体于60℃烘箱中烘3 h后,温度调至80℃，烘干至恒重, 粉碎, 混匀,置于干燥器中待测。准确称取0.5000 g黑牛肝菌粉末，超声提取20 min，在液料比为40∶1 (mL/g)，乙醇浓度设置为6个水平(30%、40%、50%、60%、70%、80%)，探究不同乙醇体积分数对多酚提取量的影响。

1.4.2 液料比对多酚提取量的影响

0.5000 g黑牛肝菌粉末,超声提取20 min,乙醇浓度70%条件下，液料比设置6个水平(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)，探究不同液料比对多酚提取量的影响。

1.4.3 超声时间对多酚提取量的影响

0.5000 g黑牛肝菌粉末，超声提取20 min，液料比为40∶1 (mL/g)，乙醇浓度70%，提取时间因素设置5个水平(10、15、20、25、30 min)，探究超声时间对多酚提取量的影响。

1.4.4 提取次数对多酚提取量的影响

在超声提取20 min，液料比为40∶1(mL/g)，乙醇浓度70%，提取次数因素设置5个水平(1、2、3、4、5次)，探究提取次数对多酚提取量的影响。

1.5 响应面法试验

利用Design- Expert 8.0.6.1软件中的Box-Behnken设计四因素三水平试验。按照单因素试验结果，响应面试验选用乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)四个因素作为试验因素，以多酚提取量为考察指标，对黑牛肝菌中多酚提取工艺进行优化，进而找出其最佳工艺条件[7-11]，试验因素水平见表1。

表1 试验因素水平设计

1.6 抗氧化实验

1.6.1 清除DPPH自由基能力的测定

取1.00 mL DPPH溶液于比色管中，分别加入1.00 mL不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的样品溶液或Vc溶液，室温避光反应30 min，无水乙醇调零[10]，517 nm处测定其吸光值A2。

A1:反应时间t=0时的空白吸光度；A2:样品液或Vc溶液在室温避光反应30 min时的吸光度。

1.6.2 清除ABTS+自由基能力的测定

取4.00 mL ABTS+溶液于10 mL比色管中，分别加入1.00 mL不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的样品液或Vc溶液，反应10 min，734 nm测吸光度A2[11]。

A1:空白对照的吸光度；A2:样品液或Vc溶液的吸光度。

1.6.3 还原Fe3+能力的测定

取2.50 mL不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的样品液或Vc溶液于比色管中,依次吸取2.50 mL 浓度为 0.20 mol/L的磷酸缓冲溶液(pH 6.6)、2.50 mL质量分数1%的铁氰化钾溶液，在50℃水浴20 min后快速冷却，加入2.50 mL质量分数10%的三氯乙酸溶液，静置10 min，取上层清液2.50 mL，加入0.50 mL质量分数0.1%三氯化铁溶液室温下放置10 min,700 nm下测定吸光度A[12]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对黑牛肝菌多酚提取量的影响

由图1可知, 黑牛肝菌中多酚的提取量随乙醇浓度的增大先增大后减小，浓度为60%时达到最大，之后乙醇浓度增大多酚提取量降低，原因可能是高浓度乙醇溶液会增大整个提取体系的粘度，不仅降低多酚的析出，还会增大一些醇溶型杂质和多糖等一些大极性成分的溶出[13]。

图1 乙醇浓度对黑牛肝菌多酚提取量的影响Fig. 1 Effects of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.1.2 液料比对黑牛肝菌多酚提取量的影响

如图2所示，在液料比低于40∶1 mL/g时，其提取量随着液料比的增大而渐渐升高，在液料比达到40∶1 mL/g时多酚提取量最大，之后则提取量逐渐降低，原因可能是在液料比40∶1 mL/g时多酚析出趋于稳定，继续增加溶剂会提高多糖或其他杂质的析出，从而使多酚的溶出受到抑制[14]。

图2 液料比对黑牛肝菌多酚提取量的影响Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on the yield ofpolyphenols

2.1.3 超声提取时间对黑牛肝菌多酚提取量的影响

如图3所示，黑牛肝菌中多酚的提取量随超声时间的增加先升后降， 在20 min时提取量最大，之后随着超声时间的增长提取量渐渐降低，原因可能是在20 min后由于提取时间过长有部分多酚发生了氧化反应，从而降低了多酚的含量[15]。

图3 超声时间对黑牛肝菌多酚提取量的影响Fig.3 Effects of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.4 提取次数对黑牛肝菌多酚提取量的影响

如图4所示，多酚提取量随提取次数的增加而缓慢增大，提取次数为2次时多酚得率最高，继续增加提取次数，长时间的超声波作用会使原料细胞破裂程度加大，增加杂质溶出，甚至破坏多酚物质的化学结构，此结论与茹月蓉等[13]对青冈栎果壳多酚的研究结果以及苏适等[16]对无花果黄酮的研究结果一致。因此，选择提取次数2次为较优条件。

图4 提取次数对黑牛肝菌多酚提取量的影响Fig.4 Effects of extraction times on the yield of polyphenols

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面试验设计结果

根据Design-Expert软件设计试验方案，如表2所示。选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为变量，选定响应值(提取量)，进行拟合分析，得到黑牛肝菌多酚提取量回归方程。

表2 响应面试验设计结果

2.2.2 响应面方差分析结果

由表3可知，黑牛肝菌提取多酚的响应曲面回归模型的系数显著性与方差分析结果，模型项F值为68.48,P<0.000 1极显著性(P<0. 01),失拟项P=0.050 7不显著(P>0.05),故利用此模型找到黑牛肝菌多酚提取量的最优提取条件。 A、B和D三个因素对黑牛肝菌中多酚影响极显著(P<0.01)。四个二次项曲面效应也同样明显，AC、BC和CD交互项效应影响极显著，影响大小顺序为:A乙醇浓度>D提取次数>B料液比>C超声提取时间。

表3 响应面方差分析结果

2.2.3 响应面分析

利用Design-Expert 软件对黑牛肝菌中多酚含量开展二次多元回归拟合，固定四个变量中的三个为不变值，把变量与另三个因素拟合为三维曲面图，拟合目标函数为数学模型，进而绘制因变量曲面图，3D响应曲面见图5。通过响应面分析，最终确定黑牛肝菌中多酚最佳提取条件，即乙醇浓度60%，液料比40∶1(mL/g)，超声提取时间20 min，提取次数2次。

图5 多酚含量与提取各因素间的交互作用Fig. 5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on the extraction rate of polyphenol

2.3 结果与分析

2.3.1 清除DPPH自由基能力

如图6所示，黑牛肝菌中多酚提取液和抗坏血酸溶液清除DPPH自由基的能力随浓度增加效果也逐步增强，且在相同浓度条件下黑牛肝菌中多酚的清除率强于抗坏血酸溶液。当浓度为0.1 mg/mL时，黑牛肝菌中多酚提取液的DPPH自由基清除率最高可达到95.45%。黑牛肝菌中提取的多酚具有强的体外抗氧化活性可能与其富含对苯二酚、对联三苯酚类物质有关[18]。

图6 清除DPPH自由基能力Fig. 6 Result of DPPH scavenging activities

2.3.2 清除ABTS+自由基能力

如图7所示，随浓度增加，黑牛肝菌多酚提取液和抗坏血酸溶液对ABTS+自由基清除率逐渐增强。在浓度为0.04 mg/mL时，黑牛肝菌多酚提取液的清除率接近90%，对ABTS+自由基具有强的清除活性。

图7 清除ABTS+自由基能力Fig. 7 Result of ABTS+ scavenging activities

2.3.3 还原Fe3+能力

如图8所示，随着黑牛肝菌提取液和抗坏血酸溶液浓度的增加，吸光度值呈递增趋势，对Fe3+还原能力增强，黑牛肝菌多酚提取液对Fe3+的还原能力在相同浓度下强于抗坏血酸溶液。

图8 还原Fe3+能力Fig. 8 Result of reducing Fe3+ activities

3 结 论

利用响应面法对黑牛肝菌中多酚提取工艺进行优化，采用DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除及还原Fe3+三种实验方法测定了其抗氧化活性。在单因素试验基础上，通过响应面试验得到黑牛肝菌中多酚最优提取工艺：乙醇浓度60%，液料比40∶1(mL/g)，提取时间20 min，提取次数2次。黑牛肝菌多酚抗氧化活性实验表明，黑牛肝菌多酚提取液具有强的清除DPPH自由基、ABTS+自由基及Fe3+还原能力，为黑牛肝菌资源的开发和利用提供科学依据。