蛭龙活血通瘀胶囊对模型大鼠脑出血后脑组织水肿及ZO-1、Occludin的影响*

王 蔚 钟 霞 杜 渊 王洪连 谭睿陟 沈宏萍 王 丽 杨思进（西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

脑出血是威胁人类健康的严重疾病之一［1］，脑水肿是脑出血后重要的继发性病变，同时也影响着该病的发展和预后，成为急性期临床治疗的关键，如果能在脑水肿形成的初期有效控制水肿的发生，将有助于脑出血神经系统功能障碍的恢复，提高患者生活质量［2］。通过前期的临床研究，我们发现，具有活血化瘀通络的蛭龙活血通瘀胶囊能有效治疗脑出血，改善患者的神经功能［3］。本实验通过观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑出血后脑含水量、脑系数以及血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1、Occludin mRNA的表达，探寻该药防治脑出血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康的SPF级SD大鼠，共96只，体质量（280±20）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号为SYXK（川）2018-065。饲养于西南医科大学实验动物研究中心，环境温度（22±2）℃，湿度30%～40%，普通饲料喂养，自由摄食及饮水。

1.2 药物及仪器 蛭龙活血通瘀胶囊（主要成分：黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等），规格0.4 g/粒，由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批号为20180216；盐酸法舒地尔注射液，规格2 mL∶30 mg/支，成都菀东药业有限公司，批号180101；兔抗鼠ZO-1多克隆抗体：Thermo Fisher；兔抗鼠Occludin多克隆抗体：Gene Tex；逆转录试剂盒：Thermo scientific；大鼠脑立体定位仪：北京众实迪创科技发展有限责任公司；ATPB457A小动物电子秤：深圳安普特电子科技有限公司；BSA224S精密电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TH-9240A电热恒温鼓风干燥箱：南京同皓干燥设备有限公司；Centrifuge 5424 R台式高速冷冻离心机，DYY-10C电泳仪：北京六一仪器厂；德国Eppenderf；NanoDrop 2000超微量分光光度计：Thermo scientific；LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪：瑞士Roche。

1.3 模型制备 大鼠称体质量后以400 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，距尾尖0.5 cm处剪断鼠尾，取血50 μL备用。用脑立体定位仪以大鼠俯卧位固定鼠头，常规备皮及消毒后，沿头皮正中纵向切开约10 mm，用30%双氧水腐蚀骨膜使前囟及冠状缝充分暴露，调节定位仪X、Y轴坐标以定位尾壳核区域，使针尖垂直于矢状缝右侧3.0 mm，前囟前0.2 mm处，用三棱针在针尖下钻开颅骨，以颅骨外板为零点调节定位仪Z轴，进针深度为6.0 mm，以5 μL/min匀速将血缓慢注入，留针约15 min后缓慢退针，用骨蜡将钻孔封闭，术后头皮并常规缝合消毒［4-5］。假手术组大鼠只进针不注血。术后按照“5分制法”对大鼠进行神经功能评分［6］，评分为1～3分则认为造模成功，可纳入实验。

1.4 分组及给药 实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀组（中药组）、盐酸法舒地尔组（西药组），各24只，各组又分为12 h、48 h、3 d、7 d 4个亚组，每个亚组6只。中药组给予蛭龙活血通瘀胶囊灌胃，每日1.2 g/kg，灌胃体积为3 mL［7］；西药组给予盐酸法舒地尔注射液腹腔注射，每日12 mg/kg［8］；假手术组和模型组每日均给予同中药组等体积的生理盐水灌胃。

1.5 标本采集与检测 1）脑含水量、脑系数。大鼠在实验规定的时点称重麻醉，快速断头取脑，去除软脑膜及表面血液，切取双侧大脑半球组织置于电子天平称重后，切取右侧大脑组织称出血侧脑湿重，再将其以110℃24 h烘干至恒重，称出血侧脑组织干重。脑组织含水量及脑系数计算公式为：脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%；脑系数（%）=全脑质量/体质量×100%［9］。2）脑组织 ZO-1、Occludin mRNA。大鼠在实验规定的时点深度麻醉后，快速取出脑组织，去除软脑膜及表面血液，切取出血侧大脑半球血肿周围脑组织，置于试管中，立即保存至-80℃冰箱。用Trizol法提取总RNA，根据ZO-1、Occludin的cDNA序列，由上海生物工程有限公司合成引物。ZO-1：上游5'-CGCAGCCAGTTCAAACAAAGTTCC-3'；下游 5'-GCAACATCAGCAATCGGTCCAAAG-3'。Occludin：上游 5'-CAACGGCAAAGTGAATGGCAAGAG-3'；下 游 5'-TCATCCACGGACAAGGTCAGAGG-3'。逆转录后按95℃ 10 min预变性，40个循环（变性95℃ 15 s，55℃15 s，72℃ 30 s）进行Real-time PCR扩增，用荧光定量PCR仪进行常规溶解曲线分析测定Ct值，以2-ΔΔCT的计算值作为相对表达水平［10］。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。采用单因素方差分析、LSD及Dunnett法进行多重比较。定量资料以（）表示。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑含水量比较 见表1。假手术组脑含水量在各时点均无明显改变（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组、中药组、西药组各时点脑含水量均有不同程度升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组术后脑含水量3 d时升高最为明显，7 d时有所下降；与模型组比较，中药组、西药组各时点脑含水量均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠脑含水量比较（%，±s）

表1 各组大鼠脑含水量比较（%，±s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。下同

组别假手术组模型组中药组西药组n 3 3 3 3术后12 h 76.593±0.185 80.409±0.484*79.144±0.158*△79.281±0.243*△术后48 h 76.538±0.224 81.130±0.116*79.330±0.103*△79.413±0.191*△术后3 d 76.583±0.083 82.242±0.118*79.583±0.320*△79.628±0.060*△术后7 d 76.540±0.163 79.743±0.548*78.325±0.778*△78.491±0.631*△

2.2 各组大鼠脑系数比较 见表2。假手术组大鼠脑系数在各时点均无明显改变（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组、中药组、西药组各时点脑系数均有不同程度升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组术后脑系数3 d时升高最为明显，7 d时有所下降；与模型组比较，中药组、西药组各时点脑系数均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠脑系数比较（%，±s）

表2 各组大鼠脑系数比较（%，±s）

组别假手术组模型组中药组西药组n 3 3 3 3术后12 h 0.520±0.010 0.644±0.014*0.601±0.003*△0.603±0.002*△术后48 h 0.519±0.010 0.653±0.007*0.605±0.004*△0.607±0.004*△术后3 d 0.522±0.005 0.685±0.005*0.612±0.006*△0.613±0.010*△术后7 d 0.521±0.005 0.638±0.011*0.582±0.008*△0.594±0.011*△

2.3 各组大鼠脑组织ZO-1 mRNA水平比较 见表3。假手术组大鼠脑组织ZO-1 mRNA水平在各时点均无明显改变（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组、中药组、西药组各时点脑组织ZO-1 mRNA水平均有不同程度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组术后ZO-1 mRNA水平于3 d时降低最为明显，7 d时有所回升；与模型组比较，中药组、西药组各时点脑组织ZO-1 mRNA水平均有不同程度升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠脑组织ZO-1 mRNA水平比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织ZO-1 mRNA水平比较（±s）

组别假手术组模型组中药组西药组n 3 3 3 3术后12 h 1.168±0.031 0.402±0.084*0.586±0.078*△0.607±0.066*△术后48 h 1.178±0.077 0.201±0.067*0.428±0.045*△0.398±0.013*△术后3 d 1.152±0.048 0.177±0.031*0.350±0.059*△0.324±0.051*△术后7 d 1.176±0.007 0.430±0.079*0.845±0.108*△0.851±0.100*△

2.4 各组大鼠脑组织Occludin mRNA水平比较 见表4。假手术组大鼠脑组织Occludin mRNA水平在各时点均无明显改变（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组、中药组、西药组各时点脑组织Occludin mRNA水平均有不同程度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组术后Occludin mRNA水平3 d时降低最为明显，7 d时有所回升；与模型组比较，中药组、西药组各时点脑组织Occludin mRNA水平均有不同程度升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 各组大鼠脑组织OccludinmRNA水平比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织OccludinmRNA水平比较（±s）

组别假手术组模型组中药组西药组n 3 3 3 3术后12 h 12.597±0.416 3.608±0.394*5.727±0.206*△5.927±0.816*△术后48 h 12.587±0.185 2.479±0.331*4.587±1.161*△4.860±0.753*△术后3 d 12.486±0.092 1.419±0.269*2.751±0.282*△2.930±0.710*△术后7 d 12.505±0.320 4.786±1.401*6.775±0.377*△7.081±0.466*△

3 讨 论

脑出血即出血性卒中，在中医学中属于广义的中风病范畴，早在《黄帝内经》中便有对该病病名、病因病机及疾病分类等的描述。历代医家对本病病机的认识包括外风致病、内风致病（肝风），另与痰浊、瘀血、气郁、气虚、毒损脑络等息息相关［11］。课题组结合前人理论基础，认为本病的病因主要责之于外风直中或肝风内动，痰湿与瘀血互结，终至血溢脉外，为本虚标实之证。其本虚以气虚为要，其标为风、痰和瘀。患者发病多为在素体气损不足的基础上，复受风邪外侵，引动体内肝风，气机失调，风阳上扰清窍，另由内停之痰浊、瘀血，致使气机阻滞，脉络瘀阻，脑络不通，日久脉冲血溢而致神机失用，故而为病。因此，本病的治疗需紧扣其基本证候要素气虚风痰瘀阻。治疗方面兼顾益气、活血、逐瘀、通络、祛风、平肝、化痰、开窍为法。中医学认为“离经之血便是瘀”“瘀血不去则新血不生”“治风先治血，血行风自灭”，根据此中医基础理论及病因病机认识，课题组将具有益气祛风、活血化瘀通络等功效的专科院内制剂蛭龙活血通瘀胶囊用于出血性中风病的治疗。蛭龙活血通瘀胶囊组方中君药黄芪用量大，意在补气，以达生血摄血、行气导滞，所谓“气行则血行”“气行则痰除”。佐以桂枝少量入方，体现“病痰饮者，当以温药和之”，并能温通经脉、祛风解肌，如《名医别录》言“宣导百药”，起“引经药”的作用。此外方中臣以有活血化瘀功效的药物包括水蛭、大血藤。水蛭善于通经脉逐瘀血，另有利尿通淋、息风止痉之效；大血藤既活血通络，又养血祛风，清热解毒；地龙清热平肝，息风止痉，利尿通络。全方共奏益气活血、化瘀通络、平肝息风之效。

咬合蛋白Occludin和闭锁小带蛋白ZO-1是血脑屏障紧密连接的主要成分，对维持血脑屏障结构的完整性具有重要作用，与血脑屏障的通透性及脑水肿形成密切相关［12-14］。动物实验证明［15-16］，正常SD大鼠脑组织中Occludin的表达呈现强阳性，而脑出血大鼠脑组织内Occludin的表达明显降低，在出血6 h时即开始下降，至脑出血后24、72 h时，Occludin持续在较低水平，定量RT-PCR结果亦显示在脑出血后，血肿周围脑组织的Occludin mRNA水平明显降低，并在72 h内均维持在较低的水平。研究报道显示［17］，黄芪对血脑屏障超微结构损坏具有改善作用，用药后因疾病导致的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达减少情况有所改善，能够减轻脑组织出血转化的发生。经本实验研究证实，与模型组比较，蛭龙活血通瘀胶囊能明显降低脑出血大鼠脑含水量、脑系数，并上调脑组织Occludin mRNA及ZO-1 mRNA的表达。由此我们认为，蛭龙活血通瘀胶囊能明显改善脑出血后脑组织水肿，其作用机制可能与上调血肿周围组织ZO-1及Occludin mRNA的表达有关。