血循环肿瘤细胞及循环游离DNA在乳腺癌临床应用的研究进展

娜 仁，贾永峰

(内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010000)

乳腺癌是一种以乳房肿块、乳头溢液和腋窝淋巴结肿大等为临床特征的常见妇科恶性肿瘤，流行病学研究显示，2018年全球185个国家和地区新增乳腺癌患者208.9万例，其中52.9%在发展中国家；死亡62.7万例，位于癌症死亡率的第五位，给患者的身体健康造成严重威胁[1，2]。随着诊疗水平的不断提高，乳腺癌患者的生存期明显延长，但因肿瘤复发及转移的影响，其死亡率仍居高不下[3]。因此，寻找与疾病病理生理学相关的标志物，对乳腺癌的早期诊断、肿瘤复发及转移的早期识别具有重要意义。近年来研究证实，循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTCs)和循环游离DNA(cell-free DNA，DNA)参与了肿瘤的复发及转移过程，对乳腺癌的临床诊断、治疗方案的制定及预后评估具有重要价值[4，5]。本文主要就CTCs、cfDNA在乳腺癌临床应用的研究进展进行综述。

1 CTCs、cfDNA概述

1.1 CTCsCTCs是一种因肿瘤原发灶或转移灶脱落侵入机体外周血液循环系统的肿瘤细胞，早在1869年Ashworth[6]就在1例乳腺癌患者的外周血中发现了CTCs。CTCs具有与肿瘤异质性相关的抗原蛋白质和遗传变异表达，这一特性使CTCs成为“液体活检”的重要检测指标，可为临床肿瘤的诊断和检测治疗提供准确信息[7]。多项临床研究表明，除乳腺癌外，CTCs也在卵巢癌、结直肠癌和肺癌等肿瘤疾病的诊疗中发挥重要作用，有望成为肿瘤疾病诊断及实时疗效评估的标志物[8～10]。

1.2 cfDNAcfDNA是循环体液中游离于细胞外的高度片段化DNA，主要由凋亡、坏死或正常的细胞主动或被动裂解后释放出，在健康人群血浆中含量较少(1～100 ng/ml)，片段较短(166 pb)[11]。肿瘤患者因核酸酶活性降低，导致cfDNA的清除率下降，故患者血浆中cfDNA一般呈高水平表达状态[12]。研究发现，cfDNA可携带相关细胞来源的遗传信息，能够在一定程度上反映实体肿瘤组织中的基因突发图谱频率，有利于肿瘤的早期诊断、疗效评价及复发转移[13]。此外，cfDNA半衰期较短，与常规的血清肿瘤标志物相比，更有利于肿瘤的实时动态监测[14]。

2 CTCs、cfDNA的检测方法

2.1 CTCs的研究手段相关动物模型实验研究[15]发现，肿瘤疾病发展过程中，大量肿瘤细胞被释放至血液循环中形成CTCs。但受血流剪切力、自身免疫系统和失巢凋亡效应的影响，仅有少数肿瘤细胞能逃过宿主免疫攻击，成功侵入远处器官，最终形成转移病灶，故外周血中CTCs的数量极少[16]。为提高CTCs的检出率，在检测前通常对CTCs进行富集，相关富集方法主要有密度梯度离心法、滤过分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞术、Can Patrol系统和液滴微流体技术等。其中，密度梯度离心法、滤过分离法和免疫磁珠分离法是第一代检测方法，主要根据CTCs的密度、体积、表面电荷等特点进行分离[17]。流式细胞术和Can Patrol系统属于第二代检测方法，Can Patrol系统结合了纳米技术和多重RNA原位分析技术，在提高CTCs回收率的同时，实现了对所有肿瘤表型CTCs的分离与鉴定[18]。液滴微流体技术是在第二代基础上研发出来的可对单个细胞进行分离的技术，该技术中，每个液滴均可作为独立的微反应器，大大降低了样品与试剂的消耗，检测敏感性和特异性更高，目前相关报道主要见于在肺癌中的临床应用[19]。在乳腺癌研究中，常用的检测方法主要包括流式细胞术、Cell Search系统、免疫荧光原位杂交和液滴微流体技术等。

2.2 cfDNA的研究手段单链构象多态性分析PCR法、限制性片段长度多态性PCR法是既往常用的cfDNA检测方法，但由于其检测敏感度较低，逐渐被数字PCR法和测序技术取代。数字PCR法是一种核酸分子绝对定量技术，该技术将单个DNA于微反应器中进行扩增，根据反应器呈现的不同荧光信号，结合相对比例和反应器体积计算出cfDNA原始浓度，从而实现cfDNA的绝对定量检测[20]。数字PCR法无需扩增标准曲线，检测速度较快，具有更高的灵敏度和准确度，但其局限性在于仅能对cfDNA已知的突变类型进行分析。测序技术可对指定区域或全部基因进行深度分析，以获取更多的肿瘤基因遗传多态性信息。当前常用的标记扩增深度测序、癌症个体化深度测序等均属于第二代测序技术。研究发现，在保证cfDNA足量的情况下，检测灵敏度、特异度与测量深度呈明显正相关，所获取的肿瘤遗传信息也随着测序深度的升高逐渐增多，但检测成本及时间也随之增加[13]。因此，临床应用时应根据研究目的及材料进行选择。

3 CTCs、cfDNA检测在乳腺癌中的临床应用

3.1 CTCs、cfDNA与乳腺癌的早期诊断乳腺癌早期几乎无明显症状，传统影像学检查在疾病早期无法及时识别，存在漏诊的风险。而早期乳腺癌的5年生存期远远高于晚期，若及时对乳腺癌进行鉴别诊断，并接受积极的治疗，患者的总体生存率及预后质量可明显提高[21]。因此，早期诊断对乳腺癌的治疗及预后具有重要意义。CTCs、cfDNA检测是乳腺癌诊断极具潜在价值的生物学指标，张潇分等[22]研究了47例乳腺癌患者外周诸血CTCs、cfDNA表达水平，研究发现乳腺癌患者的CTCs水平为(13.98±12.36)个/ml，血浆cfDNAAlu247/115指数水平为(0.769±0.387)，均明显高于良性乳腺疾病患者和健康体检者；当CTCs截断值为7.68个/ml时，诊断灵敏度、特异度分别为80.4%、96.4%；cfDNAAlu247/115截断值取0.431时，诊断灵敏度、特异度分别为71.7%%、71.4%，而二者联合检测可进一步提高检测效率。Jin等[23]研究发现，乳腺癌患者的CTCs阳性表达率明显高于良性乳腺疾病患者和健康者，且CTCs的表达水平与乳腺癌患者的肿瘤类型、分期、大小及淋巴结转移存在相关性，认为CTCs可作为乳腺癌筛查和分期诊断的辅助指标。Winn等[24]采用靶向测序技术检测19例乳腺癌患者的血浆cfDNA水平，发现cfDNA中测得的基因图谱与肿瘤组织的基因图谱是互补的，可见cfDNA对乳腺癌具有良好的诊断价值。

3.2 CTCs、cfDNA与乳腺癌的治疗及复发转移乳腺癌的临床治疗以精准化及综合性为治疗原则，根据患者的身体状况及肿瘤生物学特征，主要采用药物治疗、放疗、手术治疗或多种治疗方法联合应用等[25]，如何多元评价疗效、准确预测肿瘤的复发转移，以避免无用的毒性治疗，为临床治疗方案的制定提供补充信息，已成为当前的研究热点。徐彬等[26]对6例接受手术治疗的乳腺癌患者的外周血CTCs表达水平进行监测，发现与术前相比，3例T2期乳腺癌患者术后3、6个月时的CTCs水平呈现下降趋势，且均为出现复发和转移；3例T3期乳腺癌患者术后3、6个月时的CTCs水平呈升高趋势，术后均出现了复发和转移，提示CTCs高检出率与患者手术疗效、术后复发转移相关。NI等[27]应用CanPatrolTM技术对接受新辅助化疗的早期乳腺癌患者的CTCs水平进行检测，发现新辅助化疗后CTCs阳性患者由29例减少到8例，其中化疗方案EC-T(表阿霉素/环磷酰胺+多西紫杉醇)、TEC(多西紫杉醇/表阿霉素/环磷酰胺)分别将CTCs阳性患者从16例、13例减少到3例、5例，且CTCs的转阴率与客观缓解率存在明显相关性。一项有关CTCs、cfDNA检测对局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗疗效的预测研究[28]显示，存在高客观缓解率的患者，其CTCs、cfDNAAlu11浓度与治疗前持平，无明显增加；而低客观缓解率患者的CTCs、cfDNAAlu11浓度在新辅助化疗期间持续增加，认为新辅助治疗过程中，cfDNA浓度变化趋势与CTCs相似，二者均可作为预测乳腺癌治疗疗效的有效指标。

3.3 CTCs、cfDNA与乳腺癌的预后癌坯抗原、糖类抗原125等血清肿瘤标志物是临床常用的乳腺癌预后评估指标，但由于缺乏权威的证据支持，临床不建议将其应用于乳腺癌的术后随访复查及预后评估中[29]。2018年，美国癌症联合委员会指南在激素受体、人表皮生长因子受体2、细胞增殖因子Ki67和肿瘤组织学分级的基础上，将CTCs列为乳腺癌预后评估指标[30]。马有龙等[31]研究证实CTCs阳性表达率与中晚期乳腺癌化疗患者的预后存在相关率，他发现化疗敏感患者化疗4周后、研究终点时的外周血CTCs阳性率明显低于化疗不敏感患者，且CTCs对患者预后的预测具有较高的灵敏度和特异度。Aguilar等[32]评估了27例转移性乳腺癌化疗患者cfDNA基因组不稳定性(genomic instability，GIN)，研究发现随着GIN的升高，患者总生存期(OS)有降低的趋势，治疗后3周的高GIN值与患者的OS、进展生存期(PFS)恶化显著相关；GIN值在疾病稳定患者中的下降程度明显高于进展患者。以上结果表明，治疗早期对乳腺癌患者cfDNA的GIN值进行检测，有利于患者PFS和OS的预测。一项Meta分析研究[33]也发现，cfDNA与乳腺癌的进展生存期、总生存期较短显著相关；亚组分析结果显示，cfDNA是预测乳腺癌患者预后的良好指标。

4 总结与展望

近年来，随着对CTCs、cfDNA研究的深入，有关其在肿瘤的早期诊断、用药指导、复发转移监测及预后评估中已取得较大进展。尽管CTCs检测前的富集操作大大提高了CTCs的检出率，但受不同分子学方法检测CTCs的异质性影响，以及内外部质量控制的影响，乳腺癌CTCs的检测方法尚未达成共识，阳性率差别较大；当前，cfDNA检测仍处于研究阶段，二代测序技术虽可做到高通量，但全外显子组测序成本较高高，难以在临床应用中推广，且该技术的应用缺乏规范化的管理，仍需大规模、前瞻性临床研究验证其可行性。在未来的研究中，一方面应开展多中心大样本调研，为CTCs、cfDNA在乳腺癌的临床应用提供参考依据；另一方面应进一步筛选敏感度和特异度更高的生物学指标，与CTCs、cfDNA进行联合检测，在实现乳腺癌早期诊断的同时，为乳腺癌的治疗提供精确靶点，从而提高治疗有效性。