益生菌应用在神经精神障碍中的理论基础与前景展望

李素水 张翠芳 张亚坤 袁芳

目前已有证据支持在肠脑之间存在双向联系，一方面脑对肠道能动性、分泌、吸收和血流有调节功能；另一方面肠内信息也影响脑功能和行为，称为肠-脑轴，包括胃肠道、中枢神经系统(central nervous system,CNS)、自主神经系统(autonomic nervous system,ANS)、肠神经系统(enteric nervous system,ENS)、神经内分泌系统和免疫系统[1-5]。最新研究提示肠道微生物群对该轴具有重要的调节作用，影响神经发育和脑功能，可能是Alzheimer氏病、抑郁症和孤独症谱系障碍等神经精神疾病的病理学基础之一[6,7]。临床上也发现许多神经精神疾病常共病便秘、腹泻、腹痛等胃肠功能问题，宏基因组测序分析揭示这些疾病存在肠道微生态失调，为此提出“微生物群-肠-脑轴”强调微生物的重要作用[8]。益生菌为活的微生物，摄入适量的益生菌对宿主健康是有益的，具有广泛的生理作用，(1)调节机体免疫力，例如Weissella cibaria WIKIM28菌从泡菜中分离出来，通过调节树突细胞功能，诱导调节T细胞反应改善过敏性皮炎症状[9]。(2)平衡肠道微生物群，维护更健康的肠道环境，通过肠-脑轴保障身体健康[10]。上述功能进一步支持肠脑轴的存在，也使学者产生了浓厚兴趣，相关研究尤是在一些神经精神疾病方面取得了较大进步，为治疗疾病提供了新方法，现综述相关内容。

1 肠-脑轴间存在相互联系的证据研究

1.1 肠脑轴间的神经元路径联系 肠脑轴之间的神经联系主要有ENS和迷走神经两种。

1.1.1 ENS联系：胃肠道内的神经互联称为ENS，主要类型是ANS，负责小肠渗透性、黏膜分泌和胃肠道间血流等重要功能。ENS与ANS和CNS之间的相互作用由神经递质(肾上腺素、去甲肾上腺素和乙酰胆碱)通过感觉和运动神经元来实现，将各种信号从肠道传送到大脑[11]。Sarkar等[12]研究发现肠道微生物群通过调节ENS的神经元电生理阈值产生各种生物学效应，证据有：①在鼠结肠肠肌丛神经元中，一种称为reuteri的拟杆菌能激活钙依赖性钾通道。②在肠肌层神经元中，电刺激后长双歧杆菌NCC3001代谢产物激发动作电位峰值下降。③McVey Neufeld等[13]研究，与正常鼠相比，发现无菌鼠肌肠感觉神经元的兴奋性降低，进一步研究发现被常规化无菌鼠(即与常规饲养小鼠的肠道细菌结合)的神经元超级化后出现兴奋性增加，支持肠道细菌调节神经元电生理阈值。另外，肠道细菌对菌群早期定植和肠黏膜胶质细胞的动态平衡起了重要作用[14]。

1.1.2 迷走神经联系：肠脑之间的另一路径为第Ⅹ对颅神经迷走神经(从脑干到胃肠道)，有传出神经和传入神经。约80%的迷走神经纤维是感觉神经纤维，将机体器官状态信息传送到CNS。迷走神经有调节支气管收缩性、心率和肠能动性等重要作用。肠道微生物或益生菌的很多效应均依赖于迷走神经活性，例如：Bravo等[15]研究应用L.rhamnosus JB-1长期治疗增加特殊脑区γ-氨基丁酸(Aminobutyric acid,GABA)的mRNA表达，并减少应激产生的皮质醇以及相关焦虑、抑郁行为。鼠迷走神经切除术证实迷走神经为肠脑轴互联路径的主要调节者，但抗微生物治疗未进一步证实，提示肠脑轴之间还有独立于迷走神经之外的其他调节机制[16]。

1.2 免疫系统介导的肠脑相互联系

1.2.1 肠道微生物与免疫系统之间的关系：Bengmark[17]综述文献提出肠道微生物直接影响免疫系统，构成了肠道微生物和神经系统之间的重要间接路径。肠道中囊括了所有肠相关淋巴组织(the gut-associated lymphoid tissues,GALT)，GALT是人体内最大的淋巴组织集聚地，这些组织有效地保护机体免受微生物侵蚀。T细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells,DCs)等免疫细胞穿过血脑屏障(the blood-brain-barrier,BBB)影响大脑神经元和胶质细胞。大脑中还定居着免疫细胞，如脉络丛中的巨噬细胞和DCs，大脑实质区域的小胶质细胞以及脑脊液中的白细胞。因此，肠道微生物形成宿主免疫系统作用于CNS的神经细胞，并调节脑内免疫细胞活性。无菌鼠研究揭示肠微生物通过调节小胶质细胞活性和动态平衡改变CNS的免疫系统功能，具体表现为无菌鼠的小胶质细胞比例数和成熟性全面缺乏，导致机体先天免疫反应低下[4]。

1.2.2 循环免疫因子对大脑的影响：循环细胞因子和趋化性细胞因子经迷走神经和心室周围器官影响大脑结构和功能。另一路径是免疫因子通过BBB的可饱和转运系统直接运输到脑内[5]，使促炎性细胞因子进一步激发CNS的神经炎性，继而增加BBB渗透性，产生BBB漏引起免疫细胞渗透，炎性反应恶化和反应性神经胶质增多症，最终出现神经退行性病变[7]。另外，细胞因子改变脑内血清素、多巴胺和谷氨酸等神经递质浓度影响脑功能[18]。非炎性细胞因子也可作为肠道微生物介质调节脑功能，新生小鼠研究发现暴露抗生素引起血浆粒细胞集落刺激因子(G-CSF)下降，而G-CSF穿过BBB具有激发神经形成效应，对缺血性损伤有保护作用[19]。因此，肠微生物促进G-CSF的生成，可能对正常神经发育有治疗效应以及延缓神经退行性疾病的进程。有学者发现了淋巴系统直接进入大脑的证据，即细胞因子渗入大脑与神经组织相互作用[20]，进一步支持上述理论。

1.3 肠微生物产生神经活性物质及代谢产物作用于CNS

1.3.1 肠道微生物与神经递质的关系：肠道微生物具有产生神经递质和神经活性物质的能力。研究发现，乳杆菌属和双歧杆菌属产生GABA；埃希菌属、芽孢杆菌属和酵母菌属产生去甲肾上腺素；埃希菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属、乳杆菌属和Serratia产生多巴胺[5]。肠道微生物还调节神经活性化学前体或宿主内分泌和神经内分泌细胞间接调控神经递质产量[21]。有报道B.infantis细菌增加血浆色氨酸的利用度，色氨酸是5-HT前体，继而提高脑内5-HT浓度[2]。孢子形成的肠道细菌刺激宿主肠色素细胞产生5-HT，体内大多数5-HT由肠色素细胞合成[21]。因此，肠道益生菌可用于神经活性物质的传送工具。

1.3.2 细菌代谢产物也具有神经活性作用：细菌代谢产物主要是短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)，包括乙酸、丁酸、乳酸和丙酸，具有神经活性作用[2]。SCFAs由复合多糖发酵产生，直接与神经系统相互作用激活交感神经元，并穿过BBB影响行为和神经信号[22]。丁酸抑制组蛋白去乙酰化酶和抑制结肠细胞核因子κB(nuclear foctor κB,NF-κB)活化，产生抗炎效应，具体机制是丁酸通过解除Foxp3(Foxp3是一个转录因子)对组蛋白去乙酰化酶的抑制，产生抑制小肠炎症作用，Foxp3是惟一表达调节性T细胞的转录因子，促进调节性T细胞产生[6,23]。再者，在大脑发育的关键阶段胶质细胞摄取SCFAs可作为细胞代谢的能量来源。SCFAs与肠内分泌细胞自由脂肪酸受体结合刺激肠分泌肽类激素(如胰高血糖素样多肽1和肽酪氨酸酪氨酸)作用于下丘脑，调节食物和能量平衡[24]。

近来还发现一种称为N-酰基酰胺的偏利共生菌代谢产物与小肠内分泌细胞高度表达的G-蛋白-连接受体119(GPR119)结合，分泌肠肽类激素。偏利共生厌氧菌和病原性菌还产生甲酰肽(formyl peptides)、致病相关分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)等神经毒性物质影响肠神经系统和中枢神经系统功能，是很多神经疾病的病理学基础[25]。

1.4 CNS影响肠微生物的组成成分 CNS依据机体的饱足状态调整肠微生物组成成分和微生物总量。相关机制包括：(1)饮食改变，影响原有肠道微生物吸取营养的能力，在CNS的调节下改变微生物成分。神经系统通过调节胃肠能动性，分泌酸、碳酸氢盐和黏液等物质，维持恰当黏液层和生物膜，为肠道微生物成分改变提供更合适的生存环境[26]。(2)宿主神经元产生神经递质和肠道微生物表达的受体结合产生介导效应。细菌与宿主神经递质结合影响微生物组件功能，继而提高炎性易感性和感染性刺激[3]。(3)CNS直接或间接地调节其他信号分子释放，神经元、内分泌细胞及免疫细胞分泌细胞因子和抗微生物多肽进入肠道，Paneth细胞负责α-防御素分泌，这些分泌产物影响微生物生存和周围环境[3]。(4)神经系统通过改变上皮渗透性调节微生物成分，渗透性增加方便细菌通过与宿主黏膜微生物相互作用。在应激下，HPA轴释放皮质醇，调节肠运动和免疫系统反应，通过肾上腺皮质激素释放激素介导肥大细胞活化导致小肠渗透性增加，使微生物容易冲破免疫细胞和ENS神经细胞的堵截，结果应激所致的渗透性增加改变了肠微生物成分。动物试验包括啮齿类动物应激(如压抑和社交应激)以及非人灵长类物种的母子分离应激均报道引起肠微生物成分改变[27]，支持CNS影响肠道微生物成分。

2 CNS疾病的肠微生态失调研究

2.1 孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)[1,2,28,29]ASD是一种神经发育性障碍，其临床特点社会交往和认知功能缺陷。临床发现ASD儿童常伴有便秘、腹泻、腹痛等胃肠紊乱症状，且胃肠症状与ASD行为严重性呈正相关，进一步研究提示相关机制与肠生态失调有关,并提出伴有胃肠功能紊乱者为ASD一特殊亚型，禁食敏感食物、应用益生菌辅助治疗等营养方法能减轻胃肠症状，并改善孤独症行为症状[28]。支持上述理论的证据有ASD动物模型和ASD患儿临床研究均发现拟杆菌属减少，梭菌属增加。Strati等[30]研究发现ASD患儿存在拟杆菌门和厚壁菌门的不平衡，ASD患儿出现便秘与埃希菌属、贺氏菌属以及梭菌属XVIII增加有关。还有报道ASD儿童粪便中检测到了肠微生物改变，较多为双歧杆菌类、乳杆菌属、Sutterella、Prevotella和Ruminococcus等[26]。Rose等[29,30]最新研究，与不伴有胃肠症状的ASD相比，伴有胃肠症状者产生更多的促炎性细胞因子，与肠黏膜炎症和较少的调节细胞因子有关，提示肠道菌群失调激发机体异常免疫反应，导致更多的胃肠症状，支持上述结论。Shaaban等[31]发现益生菌能显著减少胃肠症状，并减轻ASD症状的严重性，该作者认为益生菌应作为ASD儿童重要的辅助治疗方法，也与上述理论吻合。动物试验也发现与ASD有关的细菌(拟杆菌、梭菌和脱硫弧菌)产生丙酸等SCFAs，引起相应的神经生化改变和行为缺陷，包括运动功能异常、重复行为、认知缺陷和社会交往受损[5]。因此，研究提示肠道微生态失调与ASD的病理学机制有关。

2.2 抑郁症 抑郁症是一种与应激相关的心境障碍，与HPA轴和免疫反应改变有关。啮齿类母婴分离抑郁症模型研究发现，肠道细菌的多样化减少、HPA轴反应过度和促炎性细胞因子表达增加[32]。人类抑郁症的研究通过焦磷酸测序，与健康对照组相比，抑郁症患者的粪便细菌α多样性增加，特别是拟杆菌门、变形菌门和放线菌门增加，但厚壁菌门显著减少[33]。需进一步实施相关研究。

2.3 Alzheimer氏病 Alzheimer氏病是一种常见的神经退行性疾病，也是最常见的痴呆。淀粉样蛋白-β(Aβ)肽的集聚和脑部沉积形成斑是神经元变形和痴呆发生的起始因素。应用Aβ前体蛋白(the Aβ precursor protein,APP)转基因鼠模型最新研究提示肠微生物改变有助于淀粉样蛋白的沉积[34]。APP转基因鼠表现为厚壁菌门、疣微球菌门、变形菌门和放线菌门减少，同时伴有拟杆菌门增加。与对照组转基因鼠模型相比，无菌鼠APP转基因鼠模型表现为脑Aβ淀粉样蛋白减少的病理改变，出现显著的认知缺陷。而且，在无菌转基因鼠模型中定植微生物后发现脑Aβ淀粉样蛋白增加，但是应用野生型微生物定植的对照组脑Aβ淀粉样蛋白水平却很少增加[7]。Vogt等[35]临床研究，与对照组相比，AD患者的肠微生物多样性减少以及组成成分发生改变，其中厚壁菌门、双歧杆菌属水平减少，拟杆菌门增加，与动物试验结论吻合。AD患者的脑尸检研究，与健康对照组脑相比，发现AD患者细菌种群增加和特殊菌种的比例改变[36]。在16SrRNA基因测序过程中，与对照组相比，AD患者中放线菌门的阅读次数显著增加，主要是丙菌科(propionibacteriaceae)家族成员。上述结果支持细菌迁徙到CNS引起神经疾病发生或加速疾病进程。

2.4 帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD) 多数PD患者运动缺陷发生前都经历便秘过程。粪便焦磷酸测序的临床研究发现，与对照组相比，PD患者早叶树科(Prevotellaceae)减少，肠杆菌科增加。进一步研究发现肠杆菌科与运动症状的严重性呈正相关，包括姿势不稳和步态困难[37]。另一研究应用粪便和黏膜标本发现，PD患者丁酸产生的细菌Blautia,Coprococcus和Roseburia类显著减少，丁酸具有抗炎效应，在PD患者中出现促炎性细菌硬骨菌(Ralstonia)提示肠道促炎性微生物生态失调可能是产生各种症状的部分原因，即生态失调扳机了系统炎症，继而加速PD病理学进程[38]。

总之，上述研究提示肠道微生物生态失调可能对许多疾病的病理进程都起着重要作用，尽管确切的病理学机制还未阐明，但提示微生物群在肠-脑轴中有重要作用，可能与ASD、抑郁症和痴呆等多种神经精神疾病有关。

3 益生菌应用前景

3.1 动物研究 在焦虑症、抑郁症、应激障碍和ASD等多种动物模型中发现益生菌有治疗作用，提示双歧杆菌属和乳杆菌属益生菌对机体有益。

3.1.1 母婴分离模型[39]：母婴分离模型是指将刚出生的幼鼠与母鼠分离制作的应激刺激模型。母婴分离小鼠表现为在强制游泳测试中执行较差，以及脑杏仁核区域发现炎症和促肾上腺皮质激素释放因子mRNA表达增加。应用B.infantis益生菌治疗能反转小鼠的行为缺陷和炎症(通过白细胞介素-6的释放)，同时发现血浆色氨酸水平明显升高，提示该益生菌减轻应激所致炎性反应，提高神经递质浓度。

3.1.2 雌性免疫活化(the maternal immune activation,MIA)鼠模型[40]：该模型称为ASD模型，表现为胃肠屏障缺陷和肠微生物成分改变。口服人类偏利共生细菌脆弱拟杆菌，能矫正肠渗透性和微生物成分异常，同时改善交流缺陷、焦虑样行为和感觉运动行为。还发现经拟杆菌治疗后4-乙基苯基硫酸盐等代谢产物也恢复正常水平，该代谢物与焦虑样行为有关。

3.1.3 益生菌的作用机制：Janik等[41]应用L.rhamnosus JB-1益生菌对鼠进行治疗，然后通过磁共振光谱仪检测发现益生菌直接调节神经递质浓度的证据，显示脑谷氨酸、N-乙酰天门冬氨酸和GABA水平增加，表明益生菌调节脑活性，使益生菌转化为临床治疗神经精神疾病成为可能。益生菌作用于肠-脑轴发挥其效应，其中减轻炎症就是很好的证据，B.infantis 35624和L.rhamnosus JB-1两种益生菌使血浆抗炎细胞因子IL-10浓度增加，并减少干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α浓度，产生抗炎效应。益生菌也改善BBB的完整性，继而减轻神经疾病患者的神经炎性效应[5]。另外，给予无菌鼠实施B.infantis益生菌还发现脑源性神经营养因子和N-甲基-D天门冬氨酸受体亚型2a的表达，这些分子对皮层和海马区学习和记忆过程有重要作用，而没有益生菌的无菌鼠则表达显著减少。这些结果支持益生菌作用于肠-脑轴产生抗炎效果，减轻特殊脑区的局部炎性反应。最新的观点也认为益生菌能调节神经形成，对ASD、癫痫、AD和PD等神经精神疾病有益，有必要开展更多的临床对照研究探讨其疗效[1,2,7,42]。

3.2 人类研究 笔者发现，目前益生菌的临床研究较少，但是减轻焦虑症和抑郁症方面的证据日益增加。由L.helveticus R0052和B.longum R0175组成的益生菌，在义务健康人群中研究，口服30 d后，通过住院焦虑和抑郁症量表总体得分以及霍普金斯症状清单总体严重性进行测评，结果与安慰剂对比，益生菌组能显著减轻焦虑和抑郁症状，表明改善心境。同时测定尿自由皮质醇显示益生菌组显著减少，提示应激水平减轻，表明益生菌对大众焦虑和抑郁产生了有益效应[43]。Kato-Kataoka等[44]观察益生菌L.casei菌株减轻大学生考试应激的效果。观察正在面临一次重要学术考试的健康医学生，考试结束后分为2组，一组应用发酵L.casei菌株制作奶，另一组应用安慰剂奶，共8周。结果与对照组相比，L.casei菌株组唾液皮质醇水平较考试前显著下降，并减轻胃肠症状。进一步的粪便检测，发现益生菌组显著提高肠道微生物种类数量，但拟杆菌科比例显著下降。

益生菌在肠脑之间可能有重要调节作用，既改善胃肠功能，又调节脑功能，支持“微生物-肠-脑轴”在许多神经精神疾病的病理进程中有不可忽视的作用。肠道微生物一方面通过神经内分泌系统、神经免疫系统和自主神经系统作用于脑，另一方面微生物的毒性产物也影响脑发育[45]。目前，有很多学者试图阐明益生菌调节肠-脑轴的确切机制以及临床治疗效果，但依然不十分清楚，需进一步开展多中心的大样本研究。

肠道微生物在肠脑双向联系中的重要作用，提出“肠微生物群-肠-脑轴”概念。肠脑之间的互联有直接和间接路径，包括神经元信号、免疫介导信号和神经-内分泌介导信号。肠道微生态失调与应激反应、焦虑症、抑郁症、ASD和神经退行性疾病等多种神经精神障碍有关。益生菌能部分或全部恢复偏利共生细菌的紊乱，改善神经精神障碍的许多症状，证实肠微生物群在中枢神经系统疾病中的重要意义，提示益生菌有望成为治疗这些疾病的重要辅助手段。