microRNA在骨组织修复中的研究进展

任航，闫景龙

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨六科，黑龙江 哈尔滨 150081)

目前，由创伤、炎症或肿瘤切除导致的大节段性骨缺损及复杂类型骨折的治疗仍是骨科领域面临的难题[1]。骨组织的延迟愈合或不愈合不仅给患者带来长期疼痛，影响其生活质量，还会因反复的手术治疗增加经济负担，甚至导致患者死亡率升高，因此寻求一种提高骨组织修复质量和速度的治疗策略尤为重要。除传统手术治疗外，近年来人们还研究了骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生长因子等[2]生物疗法，以及磁场和低强度脉冲超声等[3]物理疗法，尽管这些疗法在一定程度上促进了骨组织修复，但均无法取得满意的治疗效果。已有研究表明[4]，微小RNA(micro-RNA，miRNA)作为一种调节基因表达的小型非编码RNA，对于骨、软骨和肌肉组织的发育和稳态至关重要，在骨组织修复过程中表达水平显著改变，有望成为复杂类型骨折、骨缺损等疾病治疗的新靶点。本文简要描述了miRNA的生物合成、成骨调控功能以及在骨折、骨缺损的研究现状，并且探讨了miRNA作为骨组织修复潜在的靶点。

1 miRNA在生物体内的合成

miRNA是一种非编码的单链RNA，在基因表达中起转录后调控作用。miRNA基因在基因组的基因间隔区呈聚集存在，因此它们能够转录成多顺反子转录产物[5]。miRNA的转录过程在细胞核内开始[6]：(1)最初由RNA聚合酶Ⅱ生成含有初级转录物(pri-miRNA)茎环结构；(2)然后经由核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)Drosha酶与dsRNA-结合区域蛋白DGCR8形成的多蛋白复合体加工，形成发夹环结构的前体miRNA(miRNA precursor，pre-miRNA)；(3)由内含子编码形成的pri-miRNA经剪接体处理后，同样生成pre-miRNA；(4)这两种pre-miRNA通过Ran-GTP依赖机制进入细胞质；(5)经细胞质内Dicer酶和反式激活效应元件RNA结合蛋白(TAR RNA binding protein，TRBP)加工形成长度19～25个核苷酸的双链成熟miRNA，随后双链展开形成单链miRNA；(6)单链miRNA被加载到Argonaut蛋白上，与Dicer酶共同形成RNA诱导沉默复合体；(7)miRNA与目标miRNA上的3'-非翻译区域(3’untranslated regions，3’UTR)完全结合则诱导目标miRNA的降解，不完全结合则抑制其翻译，从而抑制蛋白质合成达到目标基因的沉默。

2 miRNA在成骨中的调控作用

成骨的过程主要涉及BMP及Wnt/β联合蛋白信号通路。BMP与细胞表面I型和Ⅱ型丝氨酸-苏氨酸激酶受体结合，引起信号转导因子Smad磷酸化，形成Smad复合体，激活成骨特异性转录因子Dlx5，引起Osx和Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨特异转录因子的表达，诱导成骨分化[7]。与BMP信号通路相似，Wnt/β联合蛋白信号通路通过上调Runx2诱导成骨分化，此外BMP2还能刺激Wnt配体转录，抑制β-TrCP，协同Wnt/β联合蛋白信号通路促进成骨[8]。Zhang等[9]证明miR-93-5p与BMP-2的RNA3’ UTR不完全配对结合，通过抑制BMP-2的表达从而调控成骨分化。Fang等[10]研究证明miR-106b-5p及miR-17-5p能够靶向抑制Smad5，从而抑制BMP-2的产生及成骨分化，而使用这两种miRNA的拮抗剂，能提高Smad5的mRNA以及ALP、Runx2等成骨活性标记物的水平。Laxman等[11]研究结果表明，miR-203和miR-320b通过抑制Dlx5及其下游信号通路来抑制BMP诱导的成骨分化。Fan等[12]研究发现，miR-450b能结合成骨抑制因子BMP-3的3’UTR区，抑制其表达，促进成骨分化。Luo等[13]发现let-7i-3p通过负调节淋巴增强因子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF1)，抑制Wnt/β联合蛋白通路的表达从而抑制成骨分化。Tang等[14]发现miR-433-3p能够与Wnt信号通路的拮抗剂分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK1)miRNA的3’UTR结合，抑制其翻译，增强Wnt/β连环蛋白信号通路，促进成骨分化。综上所述，在成骨过程中micro-RNA通过调节BMP或Wnt/B连环蛋白信号通路中的相关因子，最终影响Runx2的表达，这是micro-RNA在成骨分化发挥作用的条件之一。

3 miRNA与骨折修复

3.1 miRNA在骨折后的表达 骨折的修复是一个连续的动态过程，包括血肿机化、原始骨痂形成和骨痂改造塑形三个阶段，micro-RNA的表达水平在这一过程发生显著变化[15]。Yavropoulou等[16]采用病例对照方法研究了循环miRNA与绝经后妇女低骨密度椎体骨折的联系，总共纳入了100名绝经后妇女进行研究，包括35例低骨密度且椎体骨折的患者、35例低骨密度不伴有骨折的患者以及作为对照组的30例健康人。通过检测血清样本中分离出的14种miRNA的表达水平，发现与对照组相比低骨密度患者血清miR-124、miR-2861显著升高，miR-21、miR-23和miR-29显著降低，进一步分析显示miR-21-5p在骨折患者血清样本中表达显著降低。研究人员不仅在患者血清样本中发现了异常表达的miRNA，还在患者的骨组织中发现了同样的现象。在另一临床研究中，De-Ugarte等[17]比较了因骨质疏松骨折(n=6)及骨关节炎(n=6)进行髋关节置换获得的新鲜股骨颈骨小梁组织中的miRNA的表达。该研究采用miRNA阵列分析和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术，发现miR-320a和miR-483-5p在骨质疏松骨折中显著表达。值得注意的是这两项研究存在一定的局限性，二者均采用的是骨质疏松骨折患者的样本，并非是健康人群骨折的样本，因此需要考虑骨质疏松对miRNA的影响。除了上述临床研究外，一些国内外学者还进行了动物骨折模型的miRNA分析研究。Hadjiargyrou等[18]首次报道了小鼠骨折修复早期的miRNA转录组，研究人员利用小鼠股骨单侧骨折模型，通过将骨折早期的愈伤组织及健侧骨组织分离出的miRNA与小鼠miRNA基因芯片杂交，发现与健侧骨组织相比，愈合组织中存在306个表达上调的miRNA，374个表达下调的miRNA，另有20个miRNA同时表达上调和下调。miRNA在骨折后表达水平发生显著改变，通过血清提取miRNA具有简便快捷的优点，随着检测技术的发展，miRNA能够成为骨折早期诊断及病情监测的新靶点。

3.2 miRNA在骨折的治疗研究 存在于骨髓及结缔组织中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，具备分化骨、软骨、肌肉等多种细胞系的潜能。最近一些研究表明，miRNA的表达与骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)分化成特定谱系有关。Shi等[19]将转染了miR-218 BMSC局部注射至小鼠股骨骨折部位，通过micro-CT及组织学免疫组化等方式发现miR-218能够改善新骨形成，加速骨折愈合。Lee等[20]将载有miR-29b-3p质粒转染BMSC注射至小鼠股骨骨折部位，观察其对骨折愈合的影响，发现单次注射治疗可以显著提高骨密度增加骨体积分数，而重复的注射无法增加治疗效果。然而促进骨折愈合是否是miRNA的普遍功能仍然存在争议。

miRNA还可以作为祖细胞向成骨细胞分化的负调控因子。Yao等[21]发现小鼠成骨细胞中miR-185的表达增加与甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、Wnt5b、β-连环蛋白表达减少有关，提示miR-185可能通过靶向PTH阻断Wnt/β-连环蛋白通路抑制成骨细胞生长和增殖，对成骨产生负向调节作用。Liu等[22]研究发现miR-155的过表达可以抑制裸鼠皮下间充质干细胞的异位成骨，基因检测显示在这一过程中miR-155能够通过抑制骨形态发生蛋白受体9，从而降低成骨相关基因的表达。这些研究结果表明miRNA作为内源性的转录后调节因子，对骨组织再生至关重要。基于miRNA的基因疗法对于复杂性骨折的治疗有很大潜力，仍需要进一步的体内研究来探索miRNA在骨折修复过程中各时间段的确切作用。

4 miRNA与骨缺损修复

4.1 miRNA与成骨-成血管耦联 一项系统综述[23]结果表明，miRNA通过调控新血管的生成促进骨缺损修复。骨缺损的发生常伴随着血管损伤，造成局部的缺血、缺氧，影响营养物质及干细胞的运输，导致支架材料在植入的最初阶段发生细胞死亡，引起最终的骨缺损修复的失败或延迟愈合。Ramasamy等[24]研究发现，在小鼠骨组织中存在一种对CD31强阳性的内皮细胞，具有介导血管周围骨祖细胞分化的功能。Yang等[25]采用miRNA微阵列分析，发现在CD31 hiEmcnhi内皮细胞中miR-497～195簇表达水平显著升高。研究人员通过尾静脉将构建的aptamer-agomiR-195注射至WT小鼠体内，在3个月后发现CD31 hiEmcnhi内皮细胞及成骨细胞数量成倍增加，且骨小梁的数目、体积及厚度均增高。Zhang等[26]的研究表明，提高miR-378表达能够增强BMSC成骨分化，发现转染miR-378的BMSC显著增加了Runx2、BMP-2、骨钙素(osteocalcin，OCN)等成骨基因及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和Ang-1等血管生成基因的表达水平。体外培养14d后采用基底膜基质血管造影法，发现新生血管的分支数量和长度显著高于阴性对照组。Zhang等[26]的研究结果提示miR-378可作为成骨-成血管耦合的理想靶点。此前，Eskildsen等[27]的研究已经证明antimir-138通过增强细胞外调节蛋白激酶1/2磷酸化水平以及Runx2的表达促进MSC成骨分化。Yan等[28]通过体外研究发现antimir-138能够促进MSC的VEGF的表达。研究人员利用antimir-138转染MSC薄片，将其包裹在钛棒表面并植入小鼠皮下。体内植入实验结果显示，8周后在含有antimir-138植入体的周围形成大量新生骨并且含有丰富的新生血管。以上研究结果表明，miRNA积极参与成骨-成血管耦联的调控，具有促进骨组织修复的治疗潜力，但仍需要进一步研究其确切机制。

4.2 miRNA与骨科支架材料 miRNA在大块骨缺损的治疗中具有促进组织修复作用。目前临床上针对骨缺损的治疗包括自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植，其中自体骨移植被认为是骨缺损修复的黄金标准，但是其临床应用常常受到供体部位的限制，因此近年来生物支架材料作为自体骨修复重建的一种替代方法受到人们的关注[29]。研究[30]发现将BMP等促进成骨的细胞因子联合支架材料能够诱导新骨形成，但是这些外源性细胞因子在体内半衰期短，易被快速降解，无法起到持续调控作用。而miRNA能够内源性的促进骨组织自身分泌信号，产生成骨相关细胞因子，实现大块骨缺损部位的愈合。Yang等[31]研究发现，用表达miR-21的间充质干细胞复合β-TCP材料对颅骨缺损大鼠进行治疗后，缺损部位新骨形成及矿化的体积和P-AKt及HIF-1α表达水平显著高于不含miR-21支架的对照组，而PTEN的表达水平降低，提示这一过程可能与miR-21基因靶向激活PTEN/PI3K/AKT/HIF-1α信号传导途径相关。Yuan等[32]将转染了antimiR-26a-5p的脂肪干细胞联合双相磷酸钙支架用于大鼠股骨缺损的治疗，可在第8周修复骨缺损并提高了骨密度及骨小梁的数量。Zhang等[33]合成了一种包裹miR-26a的聚乳酸微球，并将这些微球链接到脱细胞纳米纤维聚合物支架上，在空间和时间上控制miR-26a的释放，从而持续激活内源性干细胞修复骨缺损。总之miRNA联合支架材料的应用可以更快的锚准特定组织，实现对局部组织传递治疗，未来还需要深入研究支架材料的构建，从而精准的控制miRNA释放，为骨缺损的治疗提供新的策略。

5 总结与展望

随着转录组学的发展，对于miRNA的研究越来越受到关注。目前已经证明miRNA在骨折发生后表达水平显著改变，其潜在机制可能是通过调控成骨相关基因的表达影响骨折愈合[34]。此外一些特殊的miRNA还能够促进VEGF等血管生成基因表达，在成骨-成血管耦联中发挥积极作用。但是miRNA能够参与多靶点的调控，体内应用时可能发生脱靶效应导致骨以外的组织发生不良反应，未来仍要深入研究如何特异性的传递miRNA达到特定的细胞和分子靶点，这有助于研发更好的骨组织修复的治疗策略。作者认为当前miRNA在骨组织修复的治疗仍处于发展阶段，动物模型等实验结果不足以立即应用于临床，基于miRNA的诊断和治疗有望在未来发挥作用，但亟需更广泛的实验研究。