鼠类脊柱侧凸动物模型研究进展

赵彬，李凯，薛旭红，赵胜

(1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.山西医科大学第二医院骨科，山西 太原 030001)

脊柱侧凸是指脊柱椎体向侧方移位并伴有椎体旋转的三维结构性畸形。国际脊柱侧凸研究协会定义脊柱侧凸为测量全脊柱正侧位X线片Cobb角>10°[1]。据统计，全球青少年脊柱侧凸的发病率为1%～3%[2]。该疾病的发生可涉及多种因素，相关的病因学机制及遗传背景尚未明确。为研究该疾病的具体发病机制而进行人类随机对照试验不符合相关的医学伦理学要求[3]，动物模型便成为了研究其病因学及遗传学的重要工具，合适的脊柱侧凸动物模型对研究人员及临床医生深入研究该疾病的病因及病理方面有重大意义。

迄今为止，已通过各种诱导方式成功构建了鸡、兔子、青蛙、猪、山羊、绵羊及灵长类动物的脊柱侧凸模型[4]。但相关研究表明：鼠类作为经典的脊椎类哺乳动物与人类的基因组高度相似[5]；人类已经可以成功改变小鼠基因组类型，构建各种基因修饰、敲除模型；两足大鼠和小鼠在不同的模型中脊柱侧凸发生率明显高于其他动物[6]；鼠类脊柱侧凸模型可以较好的反映出与疾病相关的病理过程[1-6]。此外，由于鼠类操作简单、成本较低、繁殖周期快等特性可以在短期内产生大量的数据样本[7]，目前已成为研究脊柱侧凸相关问题的有力工具。本文将分别对先天性脊柱侧凸(congenital scoliosis，CS)和特发性脊柱侧凸(idiopathic scoliosis，IS)近年来常用的鼠类动物模型作一综述。

1 先天性脊柱侧凸(congenital scoliosis，CS)

CS是指母体妊娠期4～6周内，由于脊柱先天性发育异常引起椎体畸形或分割失败而导致脊柱矢状位排列紊乱[8]。据统计，新生婴儿CS的发病率为0.5%～1.0%[9]。目前较常用的鼠类CS动物模型有以下两种。

1.1 妊娠期雌鼠暴露于一氧化碳(CO)环境中构建CS模型 相关研究已证实：CO环境因素对孕妇、胎儿、新生婴儿有一定的生物学致畸作用[10]，CO在机体内与氧竞争血红蛋白结合位点，干扰组织氧合作用。母体在怀孕期间暴露于CO环境中，CO可通过胎盘作用于胎儿组织从而导致胎儿椎体发生异常。Loder等[11]选用DBA-1J系雌性小鼠，将怀孕的雌鼠暴露于200、400、600ppmCO环境中，新生幼鼠行脊柱X线检查观察先天性脊柱畸形，统计结果表明在600ppmCO环境中脊柱畸形发生率为77%。并在雌鼠妊娠21天周期内的不同时期分组暴露于600ppmCO环境中7h，结果雌鼠妊娠期内易受CO环境影响的时期为第9.5天。Farley等[12]在Loder等的研究基础上，追踪CO环境下产生的先天性脊柱畸形幼鼠脊柱侧凸的发展；选用DBA-1J系雌鼠在妊娠期第9.5天持续暴露于600ppmCO环境下，幼鼠出生后第42、54、61天对其进行影像学检查以及病理切片观察组织学形态，发现在去除母鼠同类相食、流产、死产等影响因素后存活的31个后代中55%发生脊柱侧凸。上述研究证明了CO环境下新生幼鼠的先天性脊柱畸形会随生长发育成为CS。小鼠与人类发育曲线的平行性使得该动物模型对CS的研究起到了重要作用，但未来的研究中需要继续探索CO环境暴露下发生CS的具体病理机制。

1.2 雌鼠妊娠期维生素A缺乏(vitamin A deficient，VAD)构建CS模型 视黄酸(retinoic acid，RA)是一种活性维生素A，在细胞分化、骨软骨发育等过程中起重要作用[13]。维生素A转化为胚胎RA受到视黄醛脱氢酶(retinal dehydrogenase，RALDH)的严格调控[14]。在脊椎动物的进化过程中RA由(RALDH1、RALDH2、RALDH3)三种RALDH合成，还可通过视黄酸受体(retinoic acid receptor，RAR)途径对胚胎产生影响[15]。Li等[16]随机将32只雌性Wistar大鼠分为对照组(常规饮食)和实验组(交配前给予VAD饮食，分娩后恢复常规)。新生大鼠2周龄后行全脊柱X线检查评估脊柱畸形的发生率，通过反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术评估RALDH和RAR在椎体及肝脏中的表达。结果表明：VAD组新生大鼠CS发生率为13.79%，对照组CS发生率为0%；VAD新生大鼠在颈部、胸部、骨盆、骶尾部及四肢区域出现明显骨骼畸形。VAD可负调节肝脏细胞及椎体中RALDH1、RALDH2、RALDH3、RAR的mRNA表达水平。Chen等[17]研究提出，内源竞争性RNA(competitive endogenousRNA，ceRNA)调控网络在CS的发病机制中起重要作用，对VAD诱导的CS形成过程中的ceRNA机制进行全面的研究，为VAD-CS的诊疗提供新方式。Chen在Li等[16]的VAD-CS模型基础上，随机将20只SD雌性大鼠分为VAD实验组和正常对照组，造模方法同上，妊娠第9天收集两组的胚胎进行基因测序分析ceRNA调控网络。提供了CS中的ceRNA数据整合分析以及非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的综合表达谱，全面鉴定了VAD-CS中胚胎体节发育的ceRNA调控网络。以上研究说明了母体VAD症可导致子代发生CS，之后应进一步探索更加全面的蛋白质组学及相关的信号传导途径。

2 特发性脊柱侧凸(idiopathic scoliosis，IS)

IS主要表现为椎体的水平面旋转、冠状面弯曲、矢状面异常排列的逐渐加重，约占脊柱侧凸病例的84%～89%[18]。在诊断前需排除由先天性、感染性、神经肌肉疾病以及椎管内异常等[19]原因导致的侧凸。IS的病因学研究包括了遗传、环境、代谢、激素、生化等[20]多个方面。目前较常见的IS鼠类模型包括下列几种。

2.1 增强中枢瘦素(leptin，LP)活性构建双足小鼠IS模型 LP是脂肪组织分泌的一种蛋白质类激素，对青春期下丘脑垂体系统、能量消耗、体重指数、骨代谢等[21]方面有一定的调节作用。Tam等[22]发现青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者血清LP水平降低，LP功能障碍可能在AIS的发生发展中起相关作用。由于小鼠在LP作用系统方面与人类相似，所以常被用来研究LP的相关生理作用[23]。Wu等[24]将50只3周龄C3H/Hej雄性小鼠行双前肢截骨，术后随机分为两组各25只，A组下丘脑注射过量表达的LP慢病毒载体，B组注射对照慢病毒载体。保持小鼠双足直立姿势继续喂养，监测生长状态。20周后行X线检查，记录各组小鼠脊柱侧凸发生率、Cobb角大小及循环血清LP含量，并进行统计学分析。结果显示：A组LP过量表达的小鼠IS发生率92%、Cobb角平均30.2°、循环血清中的瘦素含量明显高于B组，两组间差异有统计学意义。该方法成功构建了双足小鼠IS模型，并证明了中枢LP活性增强可增加IS的发病风险并促进疾病的进展。但该模型与人类AIS患者仍有部分差异：A组LP过量表达的小鼠血清中LP含量升高，与AIS患者相反；A组小鼠体重在20周后与对照组无差异，与AIS患者常表现为体重较正常人减低不符。所以有关中枢LP活性增强可导致IS发生的具体病理机制需进一步的研究。

2.2 利用体内褪黑素含量减少构建IS模型 褪黑素又称N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是由下丘脑内松果体分泌的一种胺类激素[25]。Thillard[26]在1959年通过切除两足鸡的松果体建立了与褪黑素含量减少相关联的脊柱侧凸动物模型，之后为研究褪黑素在IS发病过程中的作用，建立了各种诱导褪黑素减少导致IS的动物模型，其中使用最多的动物模型就是哺乳动物大鼠。Machida等[27]随机将45只雄性SD大鼠分组，10只四足大鼠松果体切除，20只双足大鼠松果体切除，10只双足大鼠松果体切除后植入褪黑素颗粒，5只双足大鼠行松果体假切除术。继续喂养3个月后对大鼠行脊柱X线检查，结果显示脊柱侧凸只出现在松果体切除后的双足大鼠中，其余三组只有1只出现。该研究表明与人类相似的双足站立姿势和脊柱轴向负荷机制对脊柱侧凸的发展有重要作用。Machida等[28]在之后的相似实验中指出，双足大鼠松果体切除术后褪黑素缺乏所导致的平衡功能紊乱和双足站立姿势可促进IS的发展，但松果体切除为该模型的必要条件。相关研究发现：比较各类近交系鼠，C57BL/6J小鼠的骨密度最低，因此该品系小鼠成为评价体内褪黑素对骨形成影响的最佳选择[29]。Machida等[30]使用C57BL/6J小鼠进行实验，并将切除松果体的部分C57BL/6J双足小鼠中每日规律注射褪黑素8mg/kg，5个月之后行全脊柱X线和三维CT检查小鼠脊柱。发现切除松果体导致褪黑素缺乏症的C57BL/6J双足小鼠几乎全部发生脊柱侧凸，而每日注射褪黑素治疗的C57BL/6J双足小鼠未发生脊柱侧凸。该实验证明，通过外源性的褪黑素注射疗法可以有效预防脊柱侧凸的发生与发展。另有研究指出，IS患者体内褪黑素水平明显低于同龄健康个体，表明褪黑素水平的减低与IS的发生有明显相关性[31]。但该造模方法存在实验成本高、耗时长、手术难度大、实验鼠死亡率高等明显不足[32]，因此之后的IS模型开始利用褪黑素拮抗剂抑制其在机体内的作用。Yang等[32]的实验随机将60只大鼠分三组，每组20只，A、B组在麻醉后行双侧前肢及尾骨近端截骨术构建双足大鼠模型，A、C组腹腔注射美国Sigma公司生产的褪黑素拮抗试剂Luzindole，注射剂量为0.2mg/kg。术后1个月、3个月、6个月分别对存活的大鼠行X线检查并测量Cobb角。实验结果显示：术后1个月时A、B两组的脊柱侧凸发生率无明显差异，术后3个月及6个月时A组脊柱侧凸发生率及Cobb角度数明显高于B组，C组在整个过程中未出现脊柱侧凸，该结果均有统计学意义。C组大鼠未出现脊柱侧凸说明注射褪黑素拮抗剂可增加脊柱侧凸的发病率，但单纯的褪黑素抑制或缺乏不足以发生脊柱侧凸，褪黑素水平降低在脊柱侧凸发病过程中只发挥协同作用。该结论在Wu等[33]的实验中也被证实。尽管利用褪黑素缺乏可成功构建IS模型，但褪黑素水平降低并非发生脊柱侧凸的决定性因素。褪黑素相关的通路功能障碍及在人类IS发病过程中的具体作用尚未明确，且该模型体积较小，无法进行相应的临床治疗方面的研究。

2.3 改变大脑运动皮质相关信号的调控作用构建IS模型 站立时与身体姿势保持平衡相关的脑干组织受损后可导致脊柱侧凸[34]。姿势反射由本体感觉传入调节，感觉运动处理异常或出现缺陷可导致姿势张力受损，从而引起脊柱畸形。感觉传入系统的改变可对肌张力障碍性疾病有一定影响[35]，因此单侧的轴向肌张力障碍引起的异常感觉运动与IS相关的骨骼改变有关。检测IS部分患者的躯体感觉诱发电位可发现脑皮层中N-37诱发电位出现选择性延迟现象，可能是由于本体感觉传入系统的皮质处理功能失调引起[36]。Domenech等[37]将50只Wistar大鼠随机分为皮质切除组24只(大脑右半球行开颅及右侧皮质电凝术)，假手术组16只(只开颅不破坏右侧皮质)，无干预对照组10只。术后1个月利用双脉冲电刺激并记录运动诱发电位、肌电图，术后3个月行X线检查，Cobb法测量脊柱畸形程度。结果显示：假手术组及对照组对双脉冲电刺激反应无差异、未出现脊柱侧凸大鼠；手术组大鼠右半球兴奋性明显增强、左右半球明显不对称，46%的大鼠出现脊柱侧凸畸形，平均Cobb角23°。通过该方法成功构建了IS模型证明了脊柱侧凸与皮质区兴奋性增强、感觉运动障碍有关。两个半球间运动兴奋性不对称所引起的肌张力障碍可对生长发育过程中的脊柱造成一定影响，促进脊柱侧凸的发展。

2.4 无创方法诱导下构建IS模型 Silva等[38]提出侵入性方法构建IS模型的实验动物死亡率高、耗时长，易造成脊柱周围细胞组织的改变，建议开发一种不干扰脊柱周围组织的方法诱导IS模型。Silva将24只雄性Wistar大鼠随机分为两组，每组各12只。实验组4周龄起佩戴由聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)材料制作的背心(边缘由合成树脂覆盖避免大鼠皮肤破损以及呼吸、移动受限)，持续12周。每周调整、更换PVC背心，以发展为左凸性脊柱侧凸模型。每周对大鼠进行1次全脊柱X线检查并测量Cobb角。统计分析证明：佩戴PVC背心6周后，已成功构建永久性脊柱侧凸模型[Cobb角(28±5)°]。随后收集其腹部、肋间、椎旁和两侧胸肌测定肌糖原含量，利用放射免疫法测定血浆中胰岛素含量。肌糖原是机体内重要的能源物质，过度消耗会导致机体疲劳并参与肌层肥大[39]。胰岛素在调节碳水化合物和骨骼肌相关激素代谢过程中有重要作用[40]。测定结果显示：与对照组相比，发生IS的大鼠腹部肌肉、肋间肌、椎旁肌、胸肌肌糖原储备量各减低13%、40%、20%、28%。IS大鼠的胰岛素敏感性较正常对照组下降18%。Silva成功的利用无创诱导法构建了稳定的IS模型，发现了该模型中肌糖原及胰岛素敏感性的变化，但该现象与脊柱侧凸发病过程的相关生理关系仍需进一步研究分析。

综上所述，虽然目前针对先天性脊柱侧凸、特发性脊柱侧凸的手术治疗规范与指南已较为成熟，但在疾病的早期预防、早期干预和病因研究方面有待进一步发展。从解剖学、生物力学等角度来讲，动物模型虽不能完全复制人类的脊柱结构及生理状态，但对于疾病的病因学及遗传学方面有重要意义，为此各国学者成功构建了各种类型的鼠类脊柱侧凸动物模型。以动物模型为基础的实验研究已成功揭示了多种脊柱侧凸的相关发病机制，但是距离阐明该疾病病因的最终目标仍有一定的距离。我们相信利用更加科学的动物模型针对脊柱侧凸进行深入的探索研究，会为将来该疾病的一级预防、发病率控制和临床治疗方面提供更有效的方法与思路。