RIPK3 在皮肤黑色素瘤中的表达及意义

张怡，韩雯，王莉，刘浩楠，杨宇星，王春

(新疆维吾尔自治区人民医院病理科, 新疆 乌鲁木齐 830001)

0 引言

随着人们对自身健康的关注，越来越多的黑色素瘤患者被发现，黑色素细胞是神经嵴起源的色素生成细胞，主要位于基底表皮、毛囊和眼结构中，它们也存在于神经系统和黏膜中，异常黑色素瘤细胞过度增生引起恶性黑色素瘤[1,2]。相关流行病学调查研究显示，不同人种间黑色素瘤的发病率不同，其中白种人最高、黑种人其次、亚洲人较黑种人略低[3]。但是我国黑色素瘤的发病率也呈上升趋势，恶性黑色素瘤很早就发生全身广泛转移，预后非常差，80%患者从诊断到死亡往往不超过1 年时间[4,5]，所以我们对黑色素瘤的研究应该给予更多的关注。

受体相互作用蛋白激酶-3(receptor‐ interacting protein kinase 3，RIPK3)是RIPK 家族中的重要一员，作为坏死复合体(necrosome)的关键成分之一介导细胞程序性坏死(necroptosis)的发生[6]，如果黑色素瘤细胞得不到正常的程序性坏死，无限增殖，可能会最终导致黑色素瘤的发生。本研究旨在探讨RIPK3 在皮肤黑色素瘤患者中的表达及对预后影响的意义。

1 对象和方法

1.1 对象

收集新疆维吾尔自治区人民医院病理科2018 年1 月至2020 年1 月经皮肤病理检查确诊为皮肤黑色素瘤患者组织蜡块30 例，其中男20 例，女10 例；年龄40～75 岁，平均年龄61.9岁。另设30 例正常皮肤组织作为对照组，其中男18 例，女12 例；年龄41～75 岁，平均年龄60.5 岁。两组性别、年龄差异无统计学意义。

1.2 主要试剂

RIPK3 抗体(ab56164)(英国Abcam 公司)；HRP 标记的羊抗兔二抗(美国 Santa Cruz 公司)；通用型SP 工作试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；高糖DMEM 培养基(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；胎牛血清(FBS)(美国 Biological Industries)；青霉素(华北制药股份有限公司)；链霉素(美国SIGMA 公司)；Trizol(美国Invitrogen)；RNAimax 转染试剂盒(美国Invitrogen)；反转录试剂盒(日本Takara 公司)；SYBR 预混物EX Taq I(日本Takara 公司)；Annexin V -FITC/PI 试剂盒(美国BD 公司)。

1.3 方法

先将组织石蜡进行免疫组织化学处理，进行原代表皮角质形成细胞HEKa 培养，在进行siRNA 转染及转染效率验证后，用Annexin V-FITC/PI 双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况，最终由两位实验人员分别双盲阅片，按照染色强度和阳性染色细胞所占百分比进行综合计分，阳性表达为细胞质和(或)细胞核内出现黄色、棕黄色或褐色颗粒。在400 倍镜下随机选择5 个视野，每个视野计数100 个肿瘤细胞，观察细胞染色的强度，计算阳性染色细胞的百分率。其中染色强度分为4 级，无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。细胞阳性率＜5%为0 分，5%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分。每个视野阳性细胞百分率与染色强度相乘即为该视野得分，5 个视野得分的平均值为最终得分。总计评分标准为：0 分为阴性(-)；1～4 分为弱阳性(+)；5～8 分为中度阳性(+ +)；9～12 分为强阳性(+ + +)。

1.4 统计学处理

以上所采集数据进行整理后，采用SPSS 21.0 软件包进行统计学分析，两组数据阳性率及表达强度用χ2检验表示，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

正常人群组，皮肤组织中RIPK3 表达在表皮基底层及棘层下部，阳性表达率93.3%(28/30)；黑色素瘤组，皮肤组织中有3 人RIPK3 蛋白呈弱阳性表达，其阳性率为10%(3/30)；黑色素瘤组和正常组RIPK3 蛋白在表达率相比有统计学意义(χ2=17.456，P＜0.05)，并且两组患者在表达强度上也具有统计学意义(χ2=16.946，P＜0.05)。

3 讨论

全世界最常见的皮肤恶性肿瘤是皮肤恶性黑色素瘤，它是最具侵略性的癌症之一，更容易发生转移。黑色素瘤早期可通过淋巴道和血行转移扩散到肝脏、肺和大脑等其他器官，终末阶段脑转移阶段病情进展迅速，是患者致死的主要原因；黑色素瘤也是既肺癌和乳腺癌之后最容易发生脑转移的第三大原因[7,8]。黑色素瘤早期临床症状复杂[9,10]，可总结为“ABCDE 法则”：A：非对称，色素斑的一半与另一半看起来不对称。B：边缘不规则，边缘不整或有切迹、锯齿等，不像正常色素痣那样具有光滑的圆形或椭圆形的轮廓。C：颜色改变，正常色素痣通常为单色，而黑色素瘤主要表现为污浊的黑色，也可有褐、棕、棕黑、蓝、粉、黑甚至白色等多不同颜色。D：直径，色素斑直径＞5～6mm 或色素斑明显长大时要注意；黑色素瘤通常比普通痣大，要留心直径＞5mm 的色素斑；直径大于1cm 的色素痣最好做活检评估。E：隆起，一些早期的黑色素瘤整个瘤体会有轻微的隆起。临床诊断的金标准还是皮肤的活组织检查，首先推荐的是切除活检，即病灶的完整切除，送病理检查明确诊断，但是否有远处转移需要区域淋巴结超声、胸部CT、全身骨扫描、头颅的增强MRI 等检查，有条件的患者也可行PET-CT 检查[11]。

黑色素瘤年龄分布主要在中青年女性，但男性超过55 岁后发病率也呈上升趋势[12]。我国黑色素瘤以肢端和黏膜亚型为主，晚期恶性黑色素瘤，50% ～ 80%的患者可出现肝转移，8%～46%的患者可出现脑转移[5]，虽然目前对恶性黑色素瘤的治疗取得一定的进展，但是恶性黑色素瘤的预后却均不尽人意，病人的5 年生存率非常低。黑色素瘤的常规治疗方法包括手术、化疗和放疗等，但总体不能显著改善患者预后；随着对黑色素瘤机制研究的不断深入及现代生物技术的不断发展，肿瘤靶向治疗等新型治疗方案给患者带来了希望；靶向治疗通过对细胞信号转导通路进行分析，针对肿瘤细胞表达的过程进行抑制，以达到促进肿瘤细胞特异性死亡的目的，所以本研究对RIPK3 蛋白在黑色素瘤患者中的作用机制进行研究，为治疗恶性黑色素瘤提供分子依据。

受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)是RIP 激酶家族中的一员，其基因位于染色体14 上，mRNA 编码518 个氨基酸的多肽。RIPK3 蛋白的N 端是有激酶活性的激酶结构域，C 端是一个退化的基序也称为RHIM，在其他蛋白分子如RIPK1、TRIF 和DAI 中也有同样结构的RHIM 基序，RIPK3 可通过这个相同的基序与其他分子发生相互作用[13]。RIPK3 在淋巴细胞、单核细胞和NK 细胞中表达较高，但在脑、视网膜、肌肉和肝脏等组织中非常低；在急性胰腺炎、缺血性损伤和神经退行性病变的动物模型中，RIPK3 蛋白被诱导大量表达后出现了坏死性凋亡[13]。在NHL 中坏死性凋亡可诱导癌细胞死亡，因此我们推测RIPK3依赖的坏死性凋亡可能在皮肤恶性黑色素瘤中发挥作用。

坏死性凋亡(necroptosis)是一种程序性细胞死亡形式，它和凋亡的不同在于细胞发生坏死性凋亡时不会出现典型的凋亡特征，而是和坏死相似，出现早期质膜完整性的丧失，细胞内容物的泄漏和细胞器肿胀，但与坏死不同的是细胞可能显示TUNEL 阳性[15]。细胞内坏死性凋亡的信号由RIPK3 与其上游连接子RIPK1、TRIF 及其下游的MLKL 合作传递。当细胞凋亡的关键因子caspases 被抑制时，坏死性凋亡可以被触发，RIPK3激活磷酸化RIPK1 形成复合物，再激活下游MLKL 转移到质膜使局部质膜的完整性不稳定，从而介导细胞死亡[16]。

通过本次研究：正常皮肤组RIPK3 阳性率为93.3%，远远高于黑色素瘤皮肤组的10%，两者的阳性率差别有统计学意义，并且在表达程度上也存在差异，说明在黑色素瘤患者皮肤组织中RIPK3 表达的降低可能与疾病的发生发展有关，可能是RIPK3 的表达下降使正常黑色素瘤细胞的程序性坏死过程被抑制而导致恶性黑色素瘤的发生。本次实验研究也存在不足，样本较少，存在一定偏倚，有待大样本的进一步研究。