IL-33基因多态性及其血清水平与云南宣威肺癌的相关性研究

吕国利 雷又鸣 李杨 施云飞 段晋 刘寅强 赵炜

肺癌是由多种细胞和细胞因子共同参与炎症反应的一种恶性肿瘤，具有较高的发病率和极高的死亡率[1]，发病机制与遗传因素、环境因素、免疫炎症反应等因素有关[2]。白细胞介素33(interleukin 33,IL-33)作为一种多功能因子，其位于5’端或第一内含子区的SNP位点，可结合位于细胞表面的致癌性抑制基因及相关受体复合物，介导炎症反应和调节免疫反应，导致IL-33血清水平发生改变[3]，大量研究证实IL-33基因多态性及IL-33水平与肿瘤的发生发展有关。云南宣威是肺癌发病率和死亡率最高的地区之一[4]，至今其发病原因仍无统一共识。IL-33基因多态性及IL-33水平是否与云南宣威肺癌的易感性有关，目前尚未发现相关报道。人类基因组扫描图谱所公布的IL-33基因rs10975521是重要SNP位点之一。因此，本研究通过分析IL-33基因rs10975521位点的多态性及血清IL-33水平与云南宣威肺癌的相关性，为云南宣威肺癌防治提供参考，现将结果报道如下。

资料与方法

一、一般资料

收集2018年5月至2019年12月在我院治疗的肺癌患者作为肺癌组，纳入标准：(1)经病理确诊原发性肺癌新发病例；(2)未经过任何手术、放疗、化疗、分子靶向等治疗。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并慢性疾病、严重代谢性疾病。符合纳入和排除标准的患者共100例，男43例，女57例；年龄27～68岁，平均(35.89±5.23)岁。同期选取100例健康人群作为对照组，男42例，女58例；年龄26～68岁，平均(35.72±5.27)岁；既往无肿瘤病史，甲胎蛋白和癌胚抗原阴性，近期无感染史。两组的年龄、性别等基线资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得我院伦理委员会批准同意，两组受试者均为云南宣威籍，相互之间不存在亲属关系，所有研究对象及家属均对本研究知情，且自愿签署知情同意书。

二、方法

1 标本采集 于清晨抽取受试者的静脉血2管(每管各约3mL),1管置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内，用于DNA的提取；另1管上离心机以3000r/min离心15min，提取血清，用于酶联免疫吸附法(ELISA)测定。

2 IL-33基因多态性实验 ①DNA提取：采用全血DNA 纯化试剂盒(美国Thermo Fisher公司)进行DNA 提取，紫外分光光度仪测定其含量，具体操作步骤按照说明书进行。②引物合成：委托上海天昊生物科技有限公司进行合成，rs10975521(正向引物：5′-TTGCATGCCAACAACAAGGAAC-3′，反向引物：5′-CCCCAACACCCAAATCTACACAA-3′，延伸引物：5′-TTTT-TTTTTTTGACAGTTCTGTAATCATATA-TATAGATATA-GATAA-3′)。③PCR扩增及基因测序：采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行扩增，PCR反应体系[样本DNA(1.0 μL)、 PCR缓冲液(2.0 μL)、dNTPs(2.0 μL)、Taq DNA聚合酶(1.0 μL)、两端引物(1.0 μL)、体积用灭菌双蒸水13 ul，共20 μL]。PCR循环(95℃ 2 min、95℃ 20 s、60℃ 1 min、72℃延伸15 min)，共24个循环。延伸产物在ABI3730XL上样并用Gene Mapper 4.1分析其基因多态性，采用测序法进一步验证结果。

3 血清IL-33测定 采用ELISA法检测血清中的IL-33表达水平，所用试剂盒购自上海恒远公司，检测者按照试剂盒操作步骤进行加样，同时设置空白对照孔及复孔，采用酶标仪在450 mm波长下测定OD值，并在标准曲线绘制软件下完成曲线绘制，计算出血清IL-33表达水平。

三、统计学方法

结 果

一、IL-33点位基因型频率在肺癌组和对照组的HWE检验

HWE定律两组IL-33 rs10975521G/A位点基因型检验显示，观测值与理论值的比较，均无统计学差异(P>0.05)，提示本实验对象具备群体代表性(见表1)。

表1 IL-33点位基因型频率在肺癌组和对照组的HWE检验

二、 IL-33基因rs10975521位点的基因型及等位基因频率在各种族人群间分布

IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型及等位基因的分布频率分别与1000 Genomes数据库中北京汉族、日本人、欧洲人、非洲人相比较，结果发现：云南宣威IL-33基因rs10975521位点的基因型及等位基因与北京人、非洲人之间具有显著性差异(P<0.05)，其余两个种族无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 IL-33基因rs10975521基因型及等位基因频率在各种族人群间分布

三、IL-33基因rs10975521基因型分布与肺癌发生风险的相关性分析

在IL-33基因rs10975521位点多态性中，肺癌组携带AA基因型频率高于对照组，肺癌组与对照组的AA、GA、GG各基因频率分布的比较，差异有统计学意义(χ2=6.066，P=0.048)。AA和GA基因型分布与GG基因型对比发现，携带AA基因型与增加肺癌风险具有相关性(OR=1.59，CI:1.18～3.53,P=0.016)；携带GA基因型与增加肺癌风险无相关性(P>0.05)。在等位基因频率中，肺癌组A等位基因占比高于对照组，肺癌组与对照组的A、G等位基因比较，差异有统计学意义(χ2=6.193，P=0.013)。A等位基因型与G等位基因型比较，A等位基因型发生肺癌风险是G等位基因型的1.35倍(OR=135，CI: 1.25～3.97,P=0.022)(见表3)。

表3 rs10975521基因型分布与肺癌发生风险的相关性分析

四、两组血清IL-33表达水平比较及不同基因型对IL-33水平的影响

肺癌组的血清IL-33表达水平(27.89±6.85)pg/mL明显高于对照组的(20.13±5.97))pg/mL，差异有统计学意义(t=8.540，P<0.001)。在IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型中，肺癌组的三种不同基因型之间血清IL-33表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组的的三种不同基因型之间血清IL-33表达水平比较，无统计学意义(P>0.05)；肺癌组AA、GA基因型的IL-33表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组GG基因型的IL-33表达水平比较，无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 两组血清IL-33表达水平比较及不同基因型对IL-33水平的影响

讨 论

IL-33位于人类第9号染色体上，编码270个氨基酸，是一种多态性细胞因子[5]，在机体内有双重作用模式，对机体的稳态维持和对外界环境变化的应答十分重要。云南宣威地区是我国肺癌的点状高发区，研究当地肺癌发病机制已成为热点和难点。探究IL-33基因多态性及其血清水平与宣威肺癌的关系，可为宣威肺癌的分子生物学角度来分析该疾病的发生与转归，为临床治疗提供参考。

IL-33是一种前炎性细胞因子，可结合白介素1(interleukin 1,IL-1)受体家族成员孤儿受体 ST2，诱导Th2细胞的生成，介导免疫和炎症反应[6]。IL-33还是一种“预警因子”，细胞坏死时，IL-33可从细胞核中释放，进而刺激多种炎症因子参与免疫调控[7]。IL-33基因多态性的分布特点因地域、种族、环境、自然等存在着很大差异[8]。本研究发现云南宣威人IL-33基因rs10975521位点分别为AA、GA、GG三种，频率分别为19.00%、48.00%、33.00%，通过与1000Genomes数据库结果比较，也发现IL-33基因rs10975521位点无论是基因型还是等位基因频率，与不同种族、不同地区人群均存在差别。基因多态性是一种普遍存在的现象，这种突变与环境有很大关系。宣威地区地处云南东北部, 拥有丰富的煤炭资源，大多数宣威居民在通风不良的家中烧黑烟(烟煤)做饭、取暖，整个生活过程都暴露在极高水平的多环芳烃(PAHs)下，这可能也是宣威人高发肺癌的关键因素。有研究表明，IL-33在胃癌、乳腺癌等多种系统肿瘤中起关键性炎症因子作用，参与肿瘤发生发展[9-12]。本研究对IL-33基因多态性与云南宣威肺癌的相关性分析发现，肺癌组在IL-33基因rs10975521位点基因型及等位基因频率的分布和对照组之间的比较有显著性差异，携带AA基因型与增加肺癌风险具有显著的相关性，其中A等位基因型发生肺癌风险是G等位基因型的1.35倍。可能是炎症环境介导IL-33释放, 由此经IL-33基因多态性rs10975521位点及ST2受体和其下游信号通路参与肿瘤的发生发展。Mousas A等[13]研究表明，IL-33基因rs146597587与嗜酸性粒细胞计数的减少存在关系。这可能解释了炎症介导IL-33释放。

IL-33可通过调节Th2细胞的分化，进而促进炎症因子的释放，加重机体炎症反应，促使肺癌患者的肺功能下降。大量研究报道，IL-33在多种慢性炎症(如肝纤维化、炎症性肠病等)及癌前病变(如宫颈上皮内瘤变、肠腺瘤等)均呈高表达[14-16]。均提示了IL-33可能在炎症向肿瘤发展的过程中发挥重要作用。Hu等[17]研究证实非小细胞肺癌病人血清中较高的IL-33水平与不良预后有关。本研究发现肺癌组的血清IL-33表达水平明显高于对照组(P<0.05)。与Kim等[18]研究报道肺癌病人血清中IL-33表达水平高于正常人的结果相符，表明肺癌的发生发展与IL-33的介导有关。其原因分析：IL-33与其受体ST2结合，刺激下游信号分子聚集，诱导Th2细胞IL-1、IL-8分泌，促进炎症反应，导致Th1/Th2失衡。而Th1/Th2失衡可诱发肺癌[19-21]。因此，血清IL-33表达也属于诱导型。本研究还发现在IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型中，肺癌组的三种不同基因型之间血清IL-33表达水平比较有差异，且血清IL-33表达水平在rs10975521的AA、GA、GG基因型为AA>GA>GG。rs1929992-AA位于IL-33基因内含子区，不太可能改变蛋白质的核心构象，但可能影响其与受体结合的亲和力，当rs1929992突变表现为AA基因型时，其位点的突变对转录活性产生了影响，同时也影响基因调控和功能[22], 导致rs10975521位点表现为AA时肺癌易感性高。血清IL-33表达是诱导型，rs10975521位点表现为AA增加肺癌易感性，肺部正常细胞坏死，会增高血清IL-33表达水平，因为IL-33可在坏死细胞核中释放出。这也提示了肺癌患者血清IL-33高表达水平很可能是受rs10975521位点表现为AA基因型的介导。

综上所述，IL-33基因rs10975521位点多态性与云南宣威肺癌易感性具有相关性，其中rs10975521位点表现为AA时可促进血清IL-33的高表达，与云南宣威肺癌发生风险相关。

本研究因局限的实验样本量，结果可能存在一定偏倚，仍需更大的样本量来进一步佐证。